आयनों एक्सचेंज राल का उपयोग कर एयरोसोल्स से वायरस का पता लगाने
Summary
एक आयनों एक्सचेंज राल आधारित विधि, तरल भिडंत के लिए अनुकूलित-आधारित वायरस के एयरोसोल नमूना प्रदर्शित किया जाता है । बहाव आणविक पता लगाने के साथ युग्मित करते हैं, विधि सतही और संवेदनशील एयरोसोल्स से वायरस का पता लगाने के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल वायरस के लिए एक स्वनिर्धारित एयरोसोल नमूना विधि दर्शाता है । इस प्रणाली में, आयनों एक्सचेंज राल तरल भिडंत के साथ युग्मित है-आधारित हवा नमूना उपकरणों के प्रभावोत्पादक एकाग्रता के लिए नकारात्मक-एयरोसोल्स से आरोप लगाया वायरस । इस प्रकार, राल में एक अतिरिक्त एकाग्रता कदम के रूप में कार्य करता है एयरोसोल नमूना कार्यप्रवाह. वायरल कणों की न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण तो आयनों एक्सचेंज राल से सीधे किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप नमूना आणविक विश्लेषण के लिए उपयुक्त के साथ. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कस्टम निर्मित एयरोसोल पर्यावरण की स्थिति की एक किस्म के तहत वायरस से लदी एयरोसोल पैदा करने में सक्षम है और ऐसे तापमान, आर्द्रता के रूप में पर्यावरण चर की सतत निगरानी के लिए अनुमति हवा की गति, और एयरोसोल जन एकाग्रता । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने का मुख्य लाभ वायरल का पता लगाने की संवेदनशीलता बढ़ जाती है, के रूप में एक unmodified पारंपरिक तरल pinger के लिए प्रत्यक्ष तुलना के द्वारा मूल्यांकन । अंय लाभ के लिए विभिंन नकारात्मक-वायरस का आरोप लगाया, आयनों विनिमय राल की कम लागत (~ नमूना प्रति $०.१४), और उपयोग में आसानी ध्यान देने की क्षमता शामिल हैं । नुकसान इस प्रोटोकॉल की अक्षमता को राल के infectivity-adsorbed वायरल कणों का आकलन शामिल है, और संभावित तरल नमूना के अनुकूलन के लिए की जरूरत है unpinger के भीतर इस्तेमाल बफर ।
Introduction
इस विधि के प्रयोजन के लिए एक अति संवेदनशील एयरोसोल नमूना मंच प्रदान करने के लिए एक गैर-एयरोसोल्स से नकारात्मक आरोप लगाया वायरस का आणविक पता लगाने की सुविधा है । सूक्ष्मजीवों, वायरल कणों सहित, समय की विस्तारित अवधि के लिए1में जीवित रह सकते हैं । एयरोसोल अपेक्षाकृत लंबी दूरी पर यात्रा कर सकते है और व्यवहार्यता और infectivity बनाए रखने, के रूप में ‘ Legionnaires रोग है कि औद्योगिक ठंडा प्रभावित व्यक्तियों से 6 किमी की दूरी पर स्थित टावरों से उत्पंन के प्रकोप का सबूत है और परिणामस्वरूप 18 मौत2. मानव के लिए वायरस के अप्रत्यक्ष संचरण के लिए एक से अधिक की मध्यस्थता कर सकते हैं और कई सेटिंग्स में हो सकता है और स्कूलों और रेस्तरां में नोरोवायरस प्रकोपों के लिए प्रदर्शन किया गया है3,4. इसी प्रकार, विषाणुओं के एयरोसोल संचरण में ऐसी सूअर और पोल्ट्री फार्मों के रूप में कृषि सेटिंग्स में हो सकता है, इस संचरण मार्ग के साथ उत्पादन सुविधाओं के बीच वायरस की आवाजाही में एक प्रमुख कारक के रूप में माना जा रहा है5, 6 , 7 , 8 , 9.
वायरस से लदी एयरोसोल का प्रभावी नमूना तेजी से निदान और प्रकोप की रोकथाम के लिए तैयारियों में सुधार के लिए अनुमति देता है, के रूप में प्रदर्शनों में दिखाया जिसमें H5 इंफ्लूएंजा एक वायरस चीन में रहते पशु बाजारों में और एयरोसोल्स से पता लगाया गया संयुक्त राज्य अमेरिका10,11। मौजूदा एयरोसोल नमूना प्रौद्योगिकियों विभिंन कण पर कब्जा सिद्धांतों की एक संख्या शामिल है, और मोटे तौर पर, और चक्रवात, प्रभाव, और फिल्टर12में वर्गीकृत किया जा सकता है । यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है exhaustively सभी लाभों और इन प्लेटफार्मों के नुकसान के लिए एक एयरोसोल से वायरस के नमूने कवर; हालांकि, यह कहा जा सकता है कि इन नमूना उपकरणों के बहुमत वायरस और bacteriophages13के संग्रह के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है । इसके अलावा, वायरल कणों की infectivity अक्सर नकारात्मक प्रभावित होता है, तरल के साथ वायरल infectivity को बनाए रखने के लिए माना जाता है और अधिक प्रभावी ढंग से ठोस प्रभाव या14फिल्टर के रूप में नमूने उपकरणों से । हालांकि, तरल भिडंत का एक नुकसान लक्ष्य कमजोर पड़ने प्रभाव है, जो होता है क्योंकि वायरस अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में एकत्र कर रहे हैं (आमतौर पर ≥ 20 एमएल) तरल के संग्रह पोत में. एक अंय महत्वपूर्ण नुकसान तरल pingers की उपइष्टतम क्षमता शामिल है कणों ध्यान केंद्रित करने के लिए < 0.5 µ m आकार15में । हालांकि, इन उपकरणों की दक्षता कैप्चर ठोस मैट्रिक्स पर स्थिरीकरण द्वारा सुधार किया जा सकता है, के रूप में स्थिरीकरण वायरल न्यूक्लिक एसिड और वायरल infectivity16,17के संरक्षण में वृद्धि कर सकते हैं ।
हम पहले से प्रदर्शित किया है कि आयनों एक्सचेंज राल कब्जा और तरल मैट्रिक्स से वायरस की एकाग्रता के लिए एक प्रभावी उपकरण है, जिसमें F-आरएनए bacteriophages, हेपेटाइटिस ए वायरस, मानव एडीनोवायरस, और रोटावायरस18,19 ,20. के रूप में निर्माता द्वारा परिभाषित, आयनों विनिमय राल इस काम में उपयोग एक macroreticular polystyrene मजबूत आधार आयनों विनिमय राल जिसमें कार्यात्मक चतुर्धातुक अमीन समूह मध्यस्थता आकर्षण और एक तरल मध्यम में ॠणायन का कब्जा21 . नतीजतन, आयनों एक्सचेंज राल के साथ वायरस पर कब्जा करने की उंमीद है नेट नकारात्मक सतह शुल्क, सहित कई प्रवेश वायरस, इंफ्लूएंजा वायरस और अंय सार्वजनिक और पशु स्वास्थ्य के लिए प्रासंगिक वायरस ।
वर्तमान प्रोटोकॉल एक तरल pinger के लिए आयनों विनिमय राल के अलावा शामिल है । इस प्रणाली में, राल वायरल के लिए एक द्वितीयक एकाग्रता कदम के रूप में कार्य करता है pinger तरल में कब्जा कर लिया कणों । न्यूक्लिक एसिड तो सीधे छोटी मात्रा में eluted, आणविक विश्लेषण के लिए एक केंद्रित नमूना प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, इस विधि का मुख्य लाभ वायरल का पता लगाने संवेदनशीलता में सुधार है, मुख्य रूप से नमूना मात्रा में कमी के माध्यम से. इसके अतिरिक्त, नकारात्मक-आरोपित वायरस के अंतर्निहित गैर-विशिष्ट कैप्चर के कारण, विधि ब्याज के वायरस की एक बड़ी संख्या का पता लगाने के लिए लागू होने की संभावना है । यहां, विधि प्रकार एक और प्रकार बी इंफ्लूएंजा वायरस और FRNA coliphage MS2 (MS2) के टीके उपभेदों के लिए प्रदर्शन किया है । इन वायरस बाद में पहले वर्णित के रूप में22मानक qRT-पीसीआर परख का उपयोग कर पता चला रहे हैं । अंत बिंदु उपयोगकर्ता इस पद्धति के प्रदर्शन में कठिनाइयों का सामना करने की उंमीद नहीं करनी चाहिए, क्योंकि वर्तमान में मौजूदा उपकरणों के संशोधनों के लिए एक एयरोसोल नमूना और विश्लेषण के पारंपरिक प्रवाह के लिए प्रमुख व्यवधान का गठन नहीं है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल को संशोधित तरल pingers का उपयोग कर एयरोसोल्स से संवेदनशील वायरल पर कब्जा करने के लिए एक विधि रूपरेखा । विधि का पता लगाने और ठहराव में वायरल लोड के लिए अनुकूलित है । विशिष्ट संशोधन यहां का प्रदर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम सीडीसी/NIOSH उच्च मैदानी कृषि स्वास्थ्य और सुरक्षा (5U54OH008085) और कोलोराडो विज्ञान डिस्कवरी मूल्यांकन अनुदान कार्यक्रम (14BGF-16) के लिए केंद्र से धन द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
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