Summary
Pluripotent kök hücre kaynaklı teratomas tedavi stratejileri araştırma kök hücre tedavisi klinik çeviri için önemlidir. Burada, ilk olarak, fare ve daha sonra seçmeli olarak hedef için kök hücre kaynaklı teratomas oluşturmak ve bu tümörler içinde bir küçük-hayvan irradiator kullanarak vivo görmek için bir protokol açıklayın.
Abstract
Kurbanlar "kök hücre Turizm," Dünya çapında, kök hücrelerin düzensiz ekimi giderek artan sayıda kök hücre transplantasyonu güvenlik kaygıları gündeme getirdi. Farklılaşmamış hücreleri oldukça daha yaygın bir uygulama nakli Ayrıştırılan rağmen teratomas hala kalan farklılaşmamış kök hücre varlığı nakli anda ortaya çıkabilir veya spontan mutasyonlar gelen farklılaşmış hücreleri. Kök hücre tedavileri kez anatomik olarak duyarlı sitelerin teslim edildiğinden, hatta küçük tümörler klinik olarak yıkıcı, körlük, felç, bilişsel anormallikler ve kardiyovasküler disfonksiyon sonucu olabilir. Bu sitelere cerrahi erişim Ayrıca hastalar birkaç tedavi olanakları ile bırakarak sınırlı olabilir. Kök hücre aksaklığı kontrol, bu nedenle, kök hücre tedavisi klinik çeviri için çok önemlidir.
Dış beam radyasyon organları çevreleyen için yaralanma en aza indirerek teratoma yükünü azaltmak için hedeflenmiş tedavi teslim, etkili bir yol sunar. Ayrıca, bu yöntem genetik manipülasyon önler veya kök hücre ki viral iletim ek klinik güvenlik ve etkinlik endişeleri ile ilişkili. Burada, bir protokol pluripotent kök hücre kaynaklı teratomas farelerde oluşturmak için ve seçmeli olarak bu tümörler içinde vivo ablate için dış beam radyasyon tedavisi uygulamak açıklar.
Introduction
Kök hücre tedavileri doku rejenerasyonu için geliştirme çabaları etkili klinik dağıtımı için engelleyici son birkaç on yıl içinde engelleri bir dizi karşılaştı. Bu engellerin zavallı hücre saklama, kök hücre immünojenisite ve form teratomas1neoplastik potansiyeline sitelerdeki içerir. Tumorigenicity özellikle klinik endişe olduğu bu kök hücre nakli alıcılar2zarar verme olasılığı vardır. Tümör oluşumu nedeniyle düzensiz kök hücre enjeksiyonları hesapları zaten birden fazla klinik ayarları3,4,5' te bildirdin. En sık klinik endişe içinde pluripotent kök hücre (PSC) gelişme gösterdi ve gecikmeler ve birden çok yüksek profilli embriyonik kök hücre (ESC) iptaller sonuçlandı ve pluripotent kök hücre (IPSC) indüklenen teratoma oluşumu için potansiyel olduğunu denemeler6,7,8,9. Böylece, uygun tedavi sağlayarak doğru iyatrojenik Bu tümörler ortaya gereken adanmış bir translasyonel araştırma için acil ihtiyaç vardır.
Bugüne kadar kök hücre hatalı davranmasından kaynaklanacak denetlemek için çoğu stratejileri PSC'ler numarasıyla tumorigenic potansiyel2,10azaltılması üzerinde odaklanmıştır. Ne yazık ki, az sayıda kalan hücreleri (örneğin., 1 x 104 1 x 105 hücreleri11' e) kadar algılama sınırın altına şu anda kullanılabilir deneyleri12', alıntı teratoma oluşumu için gereklidir 13. preseparation bu yöntemler kullanarak başka sınırlamalar arasında düşük verim ve yüksek gider, daha yeni doku mühendisliği yaklaşımlar ve hücre potansiyel bozulma için uygun olmayabilir tek hücreli süspansiyonlar güven hayatta kalma ve engraftment.
Kaç çalışmalar teratoma oluşumu takip tedavi seçenekleri ele sahip. Belki de en iyi okudu strateji "intihar" genlerin birleşme içine kök hücre14,15olduğunu. Bu yöntem, genetik olarak eğer teratomas enjekte hücreleri üretmek böylece bir kurtarma yaklaşım sağlayan farmakolojik stimülasyon postinjection tarafından etkinleştirilebilen bir indüklenebilir apoptosis aktive gen dahil etmek için kök hücre işleme içerir. Bu yaklaşım, ancak, PSC'ler ve ilaç direnci16kademeli bir gelişim potansiyeli genetik değişiklikler hedef kapalı etkileri de dahil olmak üzere önemli sakıncaları muzdarip. Benzer bir yaklaşım küçük moleküller PSC'ler Seçici hücre ölümü anti-apoptotik yolları17inhibisyonu yoluyla ikna etmek için kullanır. Diğer gruplar PSC'ler pluripotency yüzey işaretleyicileri, podocalyxin benzeri protein-1 (PODXL)18gibi karşı antikor kullanarak hücre ölümü hedef almış. Küçük molekül veya antikor teslim zamanlaması çok erken teslim ve terapötik etkinlik Eğer çok geç teslim olmayabilir PSC'ler tedavi potansiyeli üzerinde önemli bir etkiye sahip anlamına gelir. Buna ek olarak, küçük moleküller ve bu şekilde kullanılan antikorları sistemik etkileri incelenmiştir değil.
Bu tümörler tedavi için alternatif bir yaklaşım dış beam radyasyon tedavisi (EBRT) kullanarak dayanır. EBRT Şu anda solid tümör19tedavisinde istihdam birincil yöntemleri biridir. EBRT, proton ışın ve stereotaktik radyocerrahi, geliştirilmesi dahil olmak üzere yenilikleri Açıkorur EBRT teratoma adresleme için ideal hale normal doku hasarı kaçınırken hedefleme gelişmiş patolojik yapıları etkinleştirdiniz anatomik olarak hassas yapıları20oluşumu. Ayrıca, bu yöntem genetik manipülasyon veya kök hücrelerin klinik güvenlik ile dolu her ikisi de viral iletim önler ve etkinlik15ilgilendiriyor. Son olarak, mikro-irradiators gelişmeler EBRT uygulamada kemirgenler21etkinleştirdiniz.
Bu makalede, farelerde insan iPSCs enjekte edilerek teratoma oluşumu küçük hayvan modeli oluşturmak nasıl gösterir. Biz o zaman EBRT seçerek bu tümör doku çevresindeki en az hasarla vivo ortadan kaldırmak için uygulamak gösterilmiştir. Bu yaklaşım bir hedefe yönelik tedavi biyolojik moleküller üzerine çalışmaları ve peptidler sistemik teslimini ve PSC'ler genetik manipülasyon hedef kapalı etkileri kaçınırken PSC kaynaklı teratomas için sağlar. Araştırma amaçlı kök hücreleri tümör yanıtı için radyasyon tedavisi (BLI) görüntüleme bioluminescence izlemek için reporter genler ile transduce için isteğe bağlı bir adım de veriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu hayvan deney onaylanmış ve Kurumsal değerlendirme Komitesi ve laboratuvar hayvan bakım Stanford Üniversitesi'nde tarih yönetim paneli altında gerçekleştirilen.
1. hücre kültürü iPSCs
- İnsan iPSCs lentiviral 6-şey plakaları kaplı membran matris (örneğin, matrigel, bu andan matris anılacaktır) ile yeniden programlama tarafından türetilmiş büyümek.
- Her gün iPSCs zenginleştirilmiş kültür orta ile medya değiştirmek (bakınız Tablo reçetesi) 37 ° C ve % 5 CO2kuluçka.
- Hücrelerin % 80 – 90 izdiham (yaklaşık her 4 günde) ulaştığınızda, rekombinant hücre-ayrılma enzim 1 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) başına iyi ve 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya.
- 5 dk sonra pipetting tarafından iyi hücrelerden ayırmak, onları bir 15 mL tüp aktarmak ve de 300 x gsantrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü sonra süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet zenginleştirilmiş kültür orta resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) adlı bir 1:1,000 seyreltme Y27632 inhibitörü ile zenginleştirilmiş.
- Disosiye hücre hücre sayım gerçekleştirmek ve matris kaplı 6-şey plakaları bir yoğunluk 2 x 105 4 x 105için hücreleri replate.
2. iPSCs iletim bir çift-füzyon muhabir gen ile
- Geçiş iPSCs yılında 6-şey plakaları yordamına göre ve zenginleştirilmiş kültür orta ekleyebilirsiniz (bkz: Malzemeler tablo) içeren 6 µg/mL hexadimethrine bromür.
Not: 200-400 hücreler/koloni en yüksek iletim verimliliği verim için ideal koloni boyutudur. - Kendi kendine ihracı lentivirus insan Ubikuitin promotor-C tarafından 50.000 x g 4 ° C'de 2 h için bir SW-29 rotor tortu Santrifüjü tarafından tahrik ateş böceği luciferase ve yeşil flüoresan protein (FLuc-eGFP) taşıma konsantre
- Viral konsantre iPSCs enfeksiyonu (MOI) 10 çokluğu, bir 6-şey plaka ekleyin ve gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
Not: Enfeksiyon çokluğu ifade monomeric floresan protein (FACS) tarama sıralama floresans aktif bir hücre tarafından analiz tarafından tespit edilmiştir. - Ertesi gün, çıkarmak belgili tanımlık virüs vasıl 300 x g 6 dakika oda sıcaklığında IPSC 6-şey plakaların Santrifüjü tarafından.
- Medya günlük ile zenginleştirilmiş kültür orta değiştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve geçit Protokolü göre. Floresan mikroskop eGFP yaklaşık iletim verimliliği belirlemek için kullanmaktadır.
- % 30-40 bir verimlilik FACS sıralamak için yeterli olur. Hücreleri en az % 30-40 eGFP ifade edersek eGFP ifade hiPSCs FACS için devam edin.
- Ex vivo FLuc faaliyet onaylamak için GFP FACS tarafından adlı bir şey başına 5000 hücre yoğunluğuna göre ifade hücreleri plaka.
- Transduced hücreleri kuluçkaya ve (negatif kontrol görev yapacak) Sigara transduced hücreleri bioluminescence reporter ile yoklama D-biyoluminesans (100 μmol/L) için 6 h. bioluminescence Mikroplaka spectrofluorometer ile ölçmek.
3. Dorsal kanadını immünyetmezligi farelerde Teratoma oluşumu için PSC'ler nakli
- Rekombinant hücre-ayrılma enzim karışımı insan iPSCs bir çift-füzyon muhabir gen (FLuc-GFP) ile kültür (bakınız Bölüm 2) transduced içeren 6-şey plaka başına 1 mL ekleyin ve 5 min için kuluçkaya.
- Kuluçka dönemi sonra hücreler pipet aspirasyon ve ifade tarafından dağıtmak. Kültür ortamının eşit bir birim eklemek ve vasıl 250 x g 4 dk santrifüj kapasitesi.
- Santrifüjü tamamlandıktan sonra süpernatant çözüm Aspire edin, hücre Pelet matris 30 µL içinde resuspend ve canlılığı enjeksiyon önce korumak için buz yerleştirin. 1 x 106 hücre bir hemasitometre kullanarak bir hasat onaylayın.
- Çift-füzyon hücreleri muhabir gen transfected kullanan çift-pozitif FACS hücrelerden (Bölüm 2) 30 µL matris içinde askıya.
- Anestezi farelerde % 2 isoflurance 1 L/dak oksijen ile kullanarak 8-10 hafta korele çıplak teşvik ve bakım % 2 isoflurane 1 L/dak oksijen ile kullanın.
- 28,5 G kullanarak, cep/matris karışımı enjekte (bakınız Tablo reçetesi) süspansiyon, toplam 5 x 103 5 x 106 hücrelere (enjeksiyon başına yaklaşık 100 ul) bir enjeksiyon için hedef kanat, subkutan uzaya.
- Uzun süre ve büyük tümör büyüme tahmin için fareler korumak planlama bir daha kaudal enjeksiyon yeri düşünün.
- İmzalat hayvanlar üzerinde ısıtmalı bir yastık ayaktan kadar kurtarmak için izin verilen (genellikle < 1s) Solunum oranı izleme ile ten rengi ayak parmakları, ayaktan kadar.
4. bioluminescence transplante hücrelerinin hücre hayatta kalma ve Teratoma büyüme değerlendirmek için (BLI) görüntüleme
- Aşı sonra istenen timepoints mayi (IP) enjeksiyonu 375 mg/kg fareler içine muhabir inceleyebilirsek D-biyoluminesans gerçekleştirin.
- 10 dakika sonra bir IP enjeksiyon, görüntü bioluminescence sinyal (açıklandığı adım 3.5 olarak yapılır) imzalat hayvanlar için 30 dk 1 dk edinme windows 5 dk aralıklarla kullanarak.
Not: Haftalık resim satın almalar tavsiye edilir. Anestezi korunur görüntüleme sırasında sunarak inhale isoflurane üzerinden bir burun konisi. - Veri analizi için bir bölge (ROI) ilgi BLI sinyal üzerinde çizin ve sonra steradian (fotonlar/s/cm2/sr) başına santimetre kare başına saniyede maksimum fotonlar birimlerindeki emisyonları ölçmek edinme kez normalleştirmek.
5. teratoma ışınlama bir preklinik görüntü güdümlü Irradiator (Şekil 1) kullanarak
- Bir fare devirme kutusuna % 100 oksijen 1 L/dk akış hızında % 2 isoflurane kullanarak anestezi. Fare tam anestezi sonra bir görüntü güdümlü önceden klinik irradiator yatağa aktarın ( Tablo malzemelerigörmek). Anestezi % 2 isoflurane tarafından korumak sürekli üzerinden bir burun konisi.
- Mikro-CT görüntüleri 400 projeksiyon görüntüleri üzerinde 360 ° 40 kVp, 2 mA röntgen ışını kullanarak bir küme olarak alacak ve o bir izotropik piksel boyutu 0.2 mm olan hacimsel görüntüler içine yeniden.
- RT_Image yazılım paketi (http://rtimage.sourceforge.net/) kullanarak mikro-CT görüntüleri kullanarak bir radyasyon tedavi planı ve tedavi gerçekleştirmek.
Not: İki 225 kVp röntgen ışını, fare geri kalanı yüzeyine süpürgelik ve temel iç organlar tutumlu yüzeysel hedef teratoma geçmek yönelik kullanılan tedavi planı oluşur. Doz hedef tümörün ortasındaki 6 Gy olduğu kadar pozlama süreleri kirişler için üç aylık sistemi kalibrasyon verileri temel alınarak ayarlanır. - Tedavi süreci 18 Gy toplam hedef tümör sunmak için üç gün üst üste yinelemek.
- Standart tedavi sonrası bakım hayvanlar korumak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enjekte fareler genellikle teratoma büyüme oluşumu (Şekil 2) görüntüleme BLI tarafından onaylandı olarak 4-8 hafta sonra ortaya koyacak. Tümör önemli ölçüde zaman 18 Gy bir ay sonra hücre teslim, verilen luciferase sinyal (Şekil 2) önemli bir azalma sonuçlanan toplu bir doz ile ışınlanmış küçülür. Önemlisi, normal dokuların 5 mm radyasyonlu sitesinden alınan herhangi bir önemli bozukluğu (Şekil 3) için görünmez.
Şekil 1: EBRT ile tümörlerinin tedavisi için protokolünün şematik. (A) imzalat hayvan üzerinde irradiator yerleştirilir ve immobilize. (B) A scout resim hedefli tedavi için teratoma yerelleştirmek için oluşturulur. (C) RT_Image yazılım paketi kullanarak, röntgen ışınları seçili tümör hedef hizalanır. Işınlama önce kolimatör ve hayvan konumunu doğrulanır. (D) A Toplam 6 Gy radyasyon ışınlama olay22başına tümör hedefe teslim edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: başarılı Tohum hücreleri seçerek radyasyon ile tedavi edilebilir büyükçe tümörler sonuçlarında. (A)temsilcisi BLI, tedavi (sağda) ve tedavi edilmezse (sol) teratomas gösterilir. Toplamda 1 x 106 insan PSC'ler yapısal FLuc/eGFP ifade immünyetmezligi bir fare dorsal her iki yanları için enjekte edildi. Unirradiated yan büyümeye devam ederken, radyoaktif yan luciferase sinyal düşüş görüldüğü gibi önemli ölçüde küçüldü. (B) Bu çizgi grafiği unirradiated radyoaktif vs PSC kaynaklı tümörler luciferase sinyal bir düşüş gösterir. (C) teratomas içinde vivo Kaliper ölçümleri zaman içinde değişiklikler. Sigara radyasyona maruz teratomas teratomas boyutunda azalma ışınlanmış, ancak zaman içinde boyut olarak büyütülmüş. (D) A brüt Histoloji tedavi edilmemiş (solda) ve tedavi PSC kaynaklı tümör (sağda) belirgin bir azalma sonra 18 Gy radyoterapi22toplam boyutunu cinsinden gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hedef çevreleyen doku, karaciğer, bağırsak ve kas da dahil olmak üzere en az hasar sonuçlarında teslim. Çevre dokular ışınlama hasar, hücresel nükleer silahların yayılmasına karşı korunması ve hücresel yaşlanma ve Apoptozis olmayışı gibi belirtisi var. Dokular 5 mm 14 gün postirradiation, radyasyonlu sitelerden örneklenmiş. (A)Hematoksilen ve eozin boyama bitişik doku normal mimarisini gösterir. (B) Ki67 hücresel proliferasyonu bağırsak, karaciğer ve kas hücreleri korunmuş boyama (gösterildiği aqua) gösterir. Çekirdeği ile 4', 6-diamidino-2-mavi renkle gösterilen phenylindole (DAPI), counterstained. (C) A β-galaktozidaz yaşlanma tahlil hücresel yaşlanma (yani, devamsızlık yeşil boyama) kanıtı yok gösterir. (D) Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) dUTP Nick uç etiketleme (tünel) hiçbir apoptosis (yani, devamsızlık kırmızı çekirdeği içinde boyama) gösterir. Çekirdeklerin DAPI, mavi22içinde gösterilen ile counterstained. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Preklinik veri ve "kök hücre Turizm" kurbandan anekdot durumlarda teratomas gelişme riski PSC tedaviler23ile ilişkili ciddi bir sıkıntıları olduğunu onaylayın. Önlemek ve kök hücre tedavileri ile ilişkili neoplastik risk tedavi dikkatli yaklaşımlar geliştirilmesi, bu nedenle, Klinik rejeneratif kök hücre tedavileri tercümesi kolaylaştıran önemli bir adımdır. Bu makalede, PSC ilişkili teratomas EBRT bir fare modeli kullanılarak tedavi hedefleme yöntemi açıklanan ve ışınlanmış tümörlerin BLI Imaging'i kullanma dinamik atrofi gösterdi.
Biz insan iPSCs kullanılan yöntemi yeniden programlama lentivirus tarafından oluşturulan ve teratomas içinde vivo oluşumu özetlemek için bir çıplak fareler modelinde enjekte. Çıplak fareler kullanımı erken immunojenik doku reddi hücreleri türler arası iğne ile önler. Bağışıklık eksikliği fare kullanımı tumorigenic potansiyel potentiates iken, aynı iletişim kuralını kullanan fare PSC'ler immün farelerde uygulanabilir. Bu kağıt teslim edilen hücre içinde vivo seri bioluminescence görüntüleme etkin bir çift-füzyon muhabir gen ile kullanılan PSC'ler daha da transduced. Nekropsi ve histoloji boyutu veya24tümör gelişimini izlemek için güvenmek zorunda kalmadan PSC veya PSC türevleri içinde vivo seri izleme etkin muhabir gen görüntüleme kullanın. Önceki çalışmalar BLI sinyal şiddeti ve tümör boyutu25,26arasında korelasyon doğruladı. Bir çift-füzyon muhabir gen ile PSC'ler etiketleme Nekropsi gibi tümör yükünü miktar diğer yöntemleri lehine atlanabilir isteğe bağlı bir adımdır.
Radyasyon protokolü için değişiklikler için farklı dozlarda preklinik tümör tedavisi uygulanabilir. Bu yazının amaçları için 18 Gy 6 Gy 3 sürekli gün verilen üç doz idare ile temsilcisi hayvanları tedavi seçtiniz. Tüm 18 Gy bir ortamda yönetmek değil daha düşük dozlarda radyasyona ayrı sınırına bitişik doku hasarı ve morbidite EBRT için ikincil aralıklı bir avantajdır. Hastalar EBRT klinik ayarlarında kez alma düşük dozlarda bu aynı nedenlerle27için çok farklı tedaviler üzerinde aralıklı alırsınız. Diğer adımları Protokolü'nün özetlenen takip edilmelidir.
Tümör ablasyon ışınlama ile sık sık cerrahi olarak erişilemeyen alanlara teslim edilir kök hücre kaynaklı teratomas için umut verici bir tedavi stratejisidir. Bu çalışmada EBRT PSC kaynaklı teratomas tedavisi için etkili bir araç teşkil kanıt sağlar. Sonra radyasyon ışınları bir dizi bir hedef istenen bir doza bitişik doku20kaçınırken ışınlatayım için reçete bir konunun CT görüntüleri yüksek çözünürlüklü edinimi, bu basit yaklaşım gerektirir. Bu çalışmada, iki teğet kiriş subkutan PSC kaynaklı teratoma çevreleyen doku yanı sıra kontralateral denetiminin teratoma tutumlu süre tedavisi için kullanılmıştır. EBRT tümör hem verimli ve güçlü ve klinik olarak uygulanabilir, itimat küçük moleküller, antikorlar ve tümör oluşumunu önlemek için ön ayırma yöntemleri aksine tedavisidir.
Bu yaklaşımın önemli avantajı vardır. İlk olarak, dış beam radyasyon olduğunu germ hücreli tümörler19dahil olmak üzere birçok tümör türleri tedavisinde kullanılan onkolojik tedavi klinik olarak kabul edilen bir yöntemidir. Diğer tedavi stratejileri farklı olarak, EBRT önce veya hücre teslim15sırasında kök hücrelerin fonksiyonel özelliklerini değiştirmez. Ayrıca, EBRT does değil ilişmek belgili tanımlık tarz ile veya hücre sayısı teslim ve böylece potansiyel onların etkinliği üzerinde en az düzeyde etkisi vardır. Hedeflenen ışınlama hedef kapalı hasar kemoterapi için karşılaştırıldığında diğer organlara da azaltır. Son olarak, tedavi öncesi strateji ne olursa olsun, EBRT tümör oluşumu durumunda üzerine güvenilemez olabilir bir "başarısızlık durumunda güvenli" seçeneği sağlar. Yine de, kök hücre ilişkili teratoma tedavisinde EBRT gelecekteki kabulü için sınırlamalar vardır. Birincisi, tekrarlanan görüntüleme ve tedavi, bir klinik açıdan hantal olabilir teslim işlemi gerektirir. Radiosensitive doku ışın yolu ise aynı zamanda, kök hücre teslim konumuna bağlı olarak, bu yaklaşım daha yüksek risk olduğunu kanıtlayabilir. Son olarak, kök hücre sistemik enjeksiyon ve form teratomas birden çok organlarda siteleri ötesine yaymak, önemli hasta morbidite olmadan bu strateji uygulamak zor olabilir.
Sonuç olarak, PSC elde edilen teratomas bir fare modeli oluşturma bir sağlar ve tümör yükünü hedeflenen azalma sağlar mikro-CT radyoterapi güvenilir bir yöntem gösterilmektedir. Bu yöntemler EBRT tedavi edici etkinliği diğer teratoma tedavi stratejileri ile karşılaştırmak veya başka tür tümörleri ortadan kaldırılması EBRT değerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar ulusal kurumları, sağlık R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) ve 5F32HL134221 teşekkür etmek istiyorum (JWR); Howard Hughes Tıp Enstitüsü (ASL); ve desteklerinden dolayı Stanford kardiyovasküler Enstitüsü (ASL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
References
- Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).
- Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
- Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , The Stem Cell Research Community. (2012).
- Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
- Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
- Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).
- Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
- Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
- Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).
- Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
- Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284 (2016).
- Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
- Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
- Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
- Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
- Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
- Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
- Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).
- Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
- Dale, R. G.
