Gerichte en selectieve behandeling van pluripotente stamcel afkomstige Teratomas met behulp van externe Beam straling in een kleine-dier-Model

Summary

Onderzoek inzake behandelingsstrategieën voor pluripotente stamcel-afgeleide teratomas is belangrijk voor de klinische vertaling van stamcel therapie. Hier beschrijven we een protocol, ten eerste genereren van stamcellen cel afkomstige teratomas in muizen en vervolgens selectief doel en behandeling van deze tumoren in vivo met behulp van een kleine-dier-irradiator.

Abstract

Het groeiende aantal slachtoffers van “stamcel toerisme,” de niet-gereglementeerde transplantatie van stamcellen wereldwijd, heeft hun bezorgdheid over de veiligheid van stamceltransplantatie. Hoewel de transplantatie van gedifferentieerde in plaats van de ongedifferentieerde cellen is gebruikelijk, teratomas nog kunnen voortvloeien uit de aanwezigheid van residuele ongedifferentieerde stamcellen op het moment van transplantatie of van spontane mutaties in gedifferentieerde cellen. Omdat stamcel-therapieën worden vaak geleverd in anatomisch gevoelige sites, kunnen zelfs kleine tumoren rampzalig zijn klinisch, resulterend in blindheid, verlamming, cognitieve afwijkingen en cardiovasculaire dysfunctie. Chirurgische toegang tot deze sites kan ook worden beperkt, waardoor patiënten met weinig therapeutische opties. Beheersing van wangedrag van de cel van de stam is, daarom, cruciaal voor de klinische vertaling van stamcel therapie.

Externe lichtbundel straling biedt een doeltreffend middel voor het leveren van gerichte therapie te verlagen van de lasten Teratoom terwijl het minimaliseren van schade aan het omringen van organen. Bovendien, deze methode voorkomt genetische manipulatie of virale transductie van stamcellen-die zijn gekoppeld aan de extra klinische veiligheid en werkzaamheid zorgen. Hier beschrijven we een protocol pluripotente stamcel afkomstige teratomas bij muizen te maken en toe te passen therapie van de straling van de externe straal om selectief lasertherapie deze tumoren in vivo.

Introduction

De ontwikkeling van stamcel-therapieën voor weefselregeneratie is opgetreden een aantal belemmeringen in de afgelopen decennia, hinderen inspanningen voor efficiënte klinische inzet. Deze hindernissen zijn arme cel retentie bij plaatsen van levering, stamcel immunogeniciteit en de neoplastische potentie om vorm teratomas¹. Tumorigeniciteit is van bepaalde klinische zorg zoals het stamcel transplantatie ontvangers²kan beschadigen. Rekeningen van tumor vorming als gevolg van de cel van de stam van de niet-gereglementeerde injecties zijn al gemeld in meerdere klinische instellingen^3,–^4,5. Het potentieel voor Teratoom vorming is de meest vaak aangehaald klinische zorg in pluripotente stamcel (PSC) ontwikkeling en heeft geresulteerd in vertragingen en annuleringen van meerdere spraakmakende embryonale stamcellen (ESC) en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) proeven^6,7,8,9. Er is dus een dringende noodzaak voor een translationeel onderzoek gewijd naar de juiste behandeling, moeten deze iatrogene tumoren ontstaan.

Tot op heden hebben de meeste strategieën ter controle van de stamcel wangedrag gericht op het verminderen van het aantal van de PSC’s met tumorigene potentiële^2,10. Helaas, slechts een klein aantal resterende cellen (.bijvoorbeeld 1 x 10,⁴ tot en met 1 x 10⁵ cellen¹¹) is vereist voor Teratoom formatie, die is ver beneden de detectiegrens geciteerd door de momenteel beschikbare testen^{12, 13}. andere beperkingen van het gebruik van deze preseparation methoden bestaan uit lage efficiëntie en hoge kosten, afhankelijkheid van één cel schorsingen die mogelijk niet geschikt is voor nieuwere weefselengineering benaderingen, en de mogelijke bijzondere waardevermindering van cel overleving en engraftment.

Enkele studies hebben aangepakt behandelingsopties Teratoom vorming volgen. Misschien is de meest goed bestudeerde strategie de opneming van “zelfmoord” genen in stamcellen^14,15. Deze methode houdt het genetisch manipuleren van de cellen van de stam te nemen een afleidbare activeren van apoptosis gene die kan worden geactiveerd door stimulatie van de farmacologische postinjection, waardoor een redding aanpak als ingespoten cellen teratomas produceren. Deze benadering hebben echter te lijden onder belangrijke nadelen, met inbegrip van uit-target effecten van genetische modificaties van PSC’s en de mogelijkheden voor een geleidelijke ontwikkeling van drug weerstand¹⁶. Een soortgelijke aanpak maakt gebruik van kleine moleculen om selectieve celdood van PSC’s via de remming van de anti-apoptotic trajecten¹⁷. Andere groepen zijn gericht op de dood van de cel van de PSC’s met behulp van antilichamen tegen pluripotent oppervlakte markers, zoals podocalyxin-achtige eiwitten-1 (PODXL)¹⁸. De timing van de kleine-molecuul of antilichaam levering staat een aanzienlijke impact hebben op de therapeutische mogelijkheden van PSC’s als geleverd te vroeg en therapeutische werking ontbreken mag als te laat geleverd. Daarnaast zijn de systemische effecten van kleine moleculen en antilichamen gebruikt in deze mode niet onderzocht.

Een alternatieve benadering voor de behandeling van deze tumoren, is afhankelijk van de lichtbundel externe radiotherapie (EBRT) gebruiken. EBRT is één van de primaire modaliteiten die momenteel werkzaam in de behandeling van solide tumoren¹⁹. Innovaties in EBRT, met inbegrip van de ontwikkeling van de proton en stereotactische radiochirurgie, hebt ingeschakeld de verbeterde afstemming van pathologische structuren terwijl het vermijden van schade aan normale weefsel, waardoor de hoekgetrouwe EBRT ideaal is voor het aanpakken van Teratoom vorming in anatomisch gevoelige structuren²⁰. Bovendien, deze methode voorkomt de genetische manipulatie of virale signaaltransductie van cellen van de stam, die beide beladen met extra klinische veiligheid en werkzaamheid heeft betrekking op¹⁵. Tot slot hebben vooruitgang in micro-irradiators de toepassingvan EBRT in knaagdieren²¹ingeschakeld.

In dit artikel laten we zien hoe een kleine-dier om model te maken van Teratoom vorming door het injecteren van menselijke iPSCs in muizen. Vervolgens laten we zien hoe toe te passen van EBRT selectief uitroeiing van deze tumoren in vivo met minimale schade aan het omliggende weefsel. Deze aanpak biedt een gerichte therapie voor PSC-afgeleide teratomas terwijl het vermijden van de effecten van de af-target van de systemische afgifte van biologische moleculen en peptiden en de genetische manipulatie van de PSC. Voor experimentele doeleinden bieden wij een optionele stap om de cellen van de stam met reporter genen voor het bijhouden van tumor respons op stralingstherapie via bioluminescentie imaging (BLI) transduce.

Protocol

Dit dier experiment werd goedgekeurd en uitgevoerd onder de institutionele Review Board en het administratieve Panel on Laboratory Animal Care aan Stanford University. 1. de celcultuur van iPSCs Menselijke iPSCs afgeleid door lentivirale herprogrammering op 6-Wells-platen bekleed met kelder membraan matrix (bv. matrigel, aangeduid als matrix tonkilometers) groeien. Dagelijks veranderen de media van de iPSCs met verrijkte kweekmedium (Zie Tabel van materialen</strong…

Representative Results

Ingespoten muizen meestal demonstreer Teratoom groei vorming na 4 – 8 weken zoals bevestigd door BLI imaging (Figuur 2). Tumoren zal krimpen dramatisch wanneer bestraald met een cumulatieve dosis van 18 Gy gegeven van een maand na levering van de cel, wat resulteert in een aanzienlijke afname van de luciferase signaal (Figuur 2). Belangrijker, lijken normale weefsels 5 mm ontleend aan de bestraalde site niet te hebben significa…

Discussion

Bevestigen dat het risico van het ontwikkelen van teratomas een ernstig nadeel verbonden met PSC behandelingen^{23 is}preklinische gegevens en anekdotische gevallen van slachtoffers van “stamcel toerisme”. Ontwikkeling van een zorgvuldige benadering te voorkomen en behandelen van de neoplastische risico met stamcellen therapieën is daarom een belangrijke stap bij het bevorderen van de klinische vertaling van regeneratieve stamcel-therapieën. In dit artikel, we een methode van therapeutische targeti…

Materials

Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation