Tratamiento específicos y selectivo de los Teratomas derivados de células madre pluripotentes utilizando radiación de haz externo en un modelo animal de pequeño
Summary
Investigación sobre las estrategias de tratamiento de los teratomas derivados de células madre pluripotentes es importante para la traducción clínica de la terapia de células madre. Aquí, describimos un protocolo para, en primer lugar, generar derivados de células madre de los teratomas en ratones y, luego, selectivamente objetivo y tratar estos tumores in vivo utilizando un irradiador de pequeños animales.
Abstract
El creciente número de víctimas del “Turismo de células madre,” el trasplante no regulado de las células madre en todo el mundo, ha generado preocupaciones sobre la seguridad del trasplante de células madre. Aunque el trasplante del distinguido en lugar de células indiferenciadas es práctica común, los teratomas pueden surgir todavía de la presencia de células madre no diferenciadas residual en el momento del trasplante o de mutaciones espontáneas en distinguido células. Porque las terapias con células a menudo se entregan en sitios anatómicamente sensibles, incluso pequeños tumores pueden ser clínicamente devastadoras, resultando en ceguera, parálisis, anormalidades cognitivas y disfunción cardiovascular. Acceso quirúrgico a estos sitios también puede ser limitado, dejando a los pacientes con pocas opciones terapéuticas. Controlar el mal comportamiento de la célula de vástago es, por lo tanto, fundamental para la traducción clínica de la terapia de células madre.
Radioterapia externa ofrece un medio eficaz de ofrecer terapia dirigida a disminuir la carga de teratoma y reducir al mínimo lesión a órganos circundantes. Además, este método evita la manipulación genética o transducción viral de las células madre que están asociados con preocupaciones de eficacia y seguridad clínica adicional. Aquí, describimos un protocolo para crear los teratomas derivados de células madre pluripotentes en ratones y aplicar radioterapia de haz externo para ablar selectivamente estos tumores in vivo.
Introduction
El desarrollo de terapias con células madre para regeneración de tejidos ha encontrado un número de barreras en las últimas décadas, dificultando los esfuerzos para la implementación clínica eficiente. Estos obstáculos incluyen retención de células pobres en los sitios de entrega, inmunogenicidad de células madre y el potencial neoplásico de forma teratomas1. Colonización es de especial interés clínico como potencialmente puede dañar la célula de vástago trasplante los receptores2. Cuentas de la formación de un tumor debido a inyecciones de células madre se han divulgado ya en múltiples escenarios clínicos3,4,5. El potencial para la formación del teratoma es el más frecuentemente citado preocupación clínica en desarrollo (PSC) de la célula de vástago de pluripotent y ha dado lugar a retrasos y cancelaciones de alto perfil múltiples células madre embrionarias (ESC) e inducida por la célula de vástago de pluripotent (iPSC) ensayos6,7,8,9. Así, hay una necesidad urgente de una investigación traslacional dedicada a proveer un tratamiento apropiado, estos tumores iatrogénicos se produjese.
Hasta la fecha, más estrategias para controlar el mal comportamiento de la célula de vástago se han centrado en reducir el número de PSCs con potencial tumorígeno del2,10. Desafortunadamente, sólo un pequeño número de células residuales (por ejemplo., 1 x 104 a 1 x 105 células11) es necesario para la formación del teratoma, que es muy por debajo del límite de detección citada por ensayos actualmente disponibles12, 13. otras limitaciones de la utilización de estos métodos preseparación incluyen baja eficiencia y alto costo, dependencia de suspensiones unicelular que puede no ser apropiado para nuevos enfoques de la ingeniería de tejidos y el deterioro potencial de la célula supervivencia y el engraftment.
Pocos estudios han abordado las opciones de tratamiento tras formación de teratoma. Quizás la estrategia más estudiada es la incorporación de genes de “suicidio” en las células de vástago14,15. Este método consiste en manipular genéticamente las células para incorporar un gen inducible por activación de apoptosis que puede ser activado por postinjection de estimulación farmacológica, proporcionando así un enfoque de rescate si las células inyectadas producen teratomas. Este enfoque, sin embargo, adolece de importantes inconvenientes, incluidos los efectos off-target de modificaciones genéticas del PSC y la posibilidad de un desarrollo gradual de fármaco resistencia16. Un enfoque similar utiliza moléculas pequeñas para inducir muerte celular selectiva de PSC a través de la inhibición de la anti-apoptotic caminos17. Otros grupos han dirigido la muerte celular de PSCs usando los anticuerpos contra marcadores de pluripotencia la superficie, como podocalyxin-like protein-1 (PODXL)18. El momento de la entrega de moléculas pequeñas o anticuerpo se encuentra tener un impacto significativo en el potencial terapéutico de PSCs si entregado demasiado pronto y puede carecer de eficacia terapéutica si se entrega demasiado tarde. Además, no se han estudiado los efectos sistémicos de pequeñas moléculas y anticuerpos utilizados de esta manera.
Un enfoque alternativo para el tratamiento de estos tumores se basa en el uso de radioterapia de haz externo (EBRT). EBRT es una de las modalidades primarias actualmente empleadas en el tratamiento de tumores sólidos19. Innovaciones en la EBRT, incluyendo el desarrollo del haz de protones y la radiocirugía estereotáctica, han permitido la selección mejorada de estructuras patológicas evitando daño al tejido normal, lo ideal para abordar teratoma EBRT conformal formación en las estructuras anatómicamente sensibles20. Además, este método evita la manipulación genética o la transducción viral de las células madre, que se llena de seguridad clínica adicional y eficacia refiere a15. Finalmente, los avances en micro-Irradiadores han permitido la aplicación de la EBRT en roedores21.
En este artículo se demuestra cómo crear un modelo de animal pequeño de formación teratoma inyectando iPSCs humano en ratones. A continuación mostramos cómo aplicar EBRT para erradicar selectivamente estos tumores in vivo con un daño mínimo al tejido circundante. Este enfoque proporciona una terapia dirigida para los teratomas derivados de PSC, evitando los efectos off-target de la entrega sistémica de péptidos y moléculas biológicas y de la manipulación genética de los PSCs. Para fines de investigación, ofrecemos un paso opcional para transducir las células madre con genes reporteros para rastrear la respuesta del tumor a la radioterapia mediante bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los datos preclínicos y casos anecdóticos de las víctimas del “Turismo de células madre” confirman que el riesgo de desarrollar teratomas es un serio inconveniente asociado con PSC tratamientos23. Desarrollo de enfoques de cuidado para prevenir y tratar el riesgo neoplásico asociado a terapias con células madre es, por lo tanto, un paso importante para facilitar la traducción clínica de terapias regenerativas celulares. En este artículo, se describe un método de orientación terapéutica…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al nacional institutos de salud R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) y 5F32HL134221 (JWR); el Howard Hughes Medical Institute (ASL); y el Instituto Cardiovascular de Stanford (ASL) por su apoyo.
Materials
| Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
| Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
| Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
| Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
| Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
| Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
| Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
| X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
| RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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