Decellularization всего человеческого сердца внутри под давлением мешочек в Перевернутый ориентации
Summary
Этот метод позволяет decellularization комплекс твердых органа с использованием простой протокол, основанный на осмотическим шоком и перфузии ионных моющих средств с минимальными орган матрица нарушения. Она включает в себя Роман decellularization техника для человеческого сердца внутри под давлением мешочек с мониторинг в реальном времени динамику и сотовых оттока потока мусора.
Abstract
Идеальное решение для пациентов с терминальной стадии сердечной недостаточности — пересадка. Но доноров сердца ограничены, иммуносупрессия не требуется, и в конечном итоге может произойти отказ. Создание функциональных, аутологичные био искусственное сердце может решить эти проблемы. Одним из вариантов является Biofabrication сердца состоит эшафот и клеток. Естественный леску с состав ткани конкретных, а также микро – и макро архитектуры могут быть получены путем decellularizing сердца людей или крупных животных, таких как свиньи. Decellularization включает в себя мытье сотовой мусора при сохранении 3D внеклеточного матрикса и сосудистую и позволяет «cellularization» в более поздних timepoint. Опираясь на наш роман, найти что Изотопное decellularization сложных органов возможно, мы разработали более «физиологические» метод decellularize не-которые спасаютжизньпритрансплантации человеческие сердца, помещая их внутри под давлением мешочек, в Перевернутый ориентация, под контролируемого давления. Цель использования в герметичный мешок является создание градиентов давления через клапан аорты, держите его закрытые и улучшения перфузии миокарда. Одновременной оценки динамики потока и сотовой мусора во время decellularization, позволили нам контролировать жидкости приток и отток мусора, создавая тем самым эшафот, что могут быть использованы либо для простой ремонт сердца (например как патч или клапан леса) или в целом орган леску.
Introduction
Сердечная недостаточность приводит к высокой смертности больных. Параметр конечной лечения для конечной стадии сердечной недостаточности — Алло трансплантация. Однако существует длинный лист ожидания для трансплантации из-за нехватки донорских органов, и больные лица после трансплантации препятствия диапазоне от непрерывного иммуносупрессии хронической орган отклонение1,2. Функциональные сердца биоинженерии, заселив decellularized человеческого размера сердца пациента клетки могут обойти эти препятствия3.
Крупный шаг в «Инжиниринг» сердце является создание леску с соответствующим сосудистой и Паренхиматозный структуру, состав и функции для руководства выравнивание и организации поставленных клеток. При наличии надлежащих рамок клетки посеян на эшафот следует признать окружающей среды и выполнять функцию ожидаемых в рамках этого органа. По нашему мнению decellularized орган внеклеточного матрикса (dECM) включает в себя необходимые характеристики идеального эшафот.
Используя встроенные сосудистую, сложные decellularization целом орган может быть достигнуто через антеградная или ретроградным перфузии4 для удаления клеточных компонентов при сохранении деликатный 3D внеклеточного матрикса и сосудистую2, 5,6,7. Функциональный сосудистую имеет важное значение в биоинженерии целые органы просто как в естественных условиях, для распределения питательных веществ и удаление отходов8. Decellularization коронарной перфузии доказано, чтобы быть эффективным в создании decellularized сердца от крыс4, или свиней4,7,9,10,11 ,12,13и люди5,7,14,,1516. Тем не менее могут страдать от целостности клапанов, предсердиями и других «тонких» регионов.
Сердце человека размер decellularized леса могут быть получены из свиней, используя давление управления7,9,10,11,12 или настой потока скорость управления13, 17 и от человека доноров, используя давление управления5,7,14,15. Decellularization человеческих донорских сердец происходит в течение 4-8 дней под давлением, контролируемых на 80-100 мм рт.ст, в вертикальной ориентации5,,1516 или более 16 дней под давлением, контролируемых на 60 мм рт.ст14 . Под антеградная, под контролем давления decellularization, аортальный клапан компетентности играет решающую роль в поддержании эффективности коронарной перфузии и стабильное давление на корню аорты. Наши предыдущие работы показали, что ориентация сердца зависит его эффективность коронарной перфузии во время процедуры decellularization и, следовательно, эшафот целостность в конце9.
Как продолжение нашей предыдущей работы9мы вводим новые концепции, которой добавляется сумке перикарда как улучшить целом сердце decellularization. Мы описываем decellularization человеческих сердец, размещенных внутри под давлением Чехлы, обратно ориентированной и под давлением, контролируемых на 120 мм рт.ст на корню аорты. Этот протокол включает в себя мониторинг профиля потока и сбора отток средств массовой информации во всем decellularization процедуры для оценки эффективности коронарной перфузии и удаление остатков клеток. Биохимические анализы затем выполняются для проверки эффективности метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Насколько нам известно это первое исследование доклад Перевернутый decellularization человеческих сердец внутри под давлением мешочек с покадровой мониторинг потока скорость и ячейки удаления мусора. Сумке перикарда как сохраняет ориентацию сердца стабильной на протяжении всей процедуры dec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Хьюстон Дотационный Грант и Техас Фонд для новых технологий. Авторы признают агентство по закупкам орган LifeGift, Inc. и семьями донора для изготовления этого исследования возможных.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
