Decellularization van gehele menselijk hart binnen een hydrofoor tasje in een omgekeerde richting
Summary
Deze methode kan decellularization voor een complexe solide orgel met behulp van een eenvoudig protocol gebaseerd op osmotische schok en perfusie van Ionische detergent met minimale orgel matrix verstoring. Het bestaat uit een roman decellularization-techniek voor menselijke harten binnen een hydrofoor etui met real-time bewaking van flow dynamics en cellulaire puin uitstroom.
Abstract
De ultieme oplossing voor patiënten met hartfalen einde-fase is orgaantransplantatie. Maar bij immuunsuppressie is vereist, donor harten zijn beperkt en uiteindelijk afwijzing kan optreden. Het maken van een functioneel, kon autologe bio-kunsthart deze uitdagingen oplossen. Biofabrication van een hart dat bestaat uit de steiger en cellen is een optie. Een natuurlijke steiger met weefsel-specifieke samenstelling evenals micro – en macro-architectuur kan worden verkregen door decellularizing harten van mensen of grote dieren zoals varkens. Decellularization omvat cellulaire puin terwijl behoud 3D extracellulaire matrix en therapieën en “cellularization” waardoor op een later timepoint spoelen. Inspelend op onze roman vinden dat decellularization perfusie van complexe organen is mogelijk, wij een meer “fysiologisch” methode ontwikkeld om niet-transplanteerbaar menselijke harten door ze te plaatsen binnen een hydrofoor etui, in een omgekeerde decellularize oriëntatie, onder gecontroleerde druk. Het doel van het gebruik van een hydrofoor zakje is druk om kleurovergangen te maken over de aortaklep het gesloten houden en verbeteren van myocardiale perfusie. Gelijktijdige beoordeling van de dynamiek van de stroom en cellulaire puin verwijdering tijdens decellularization konden we ten aanzien van zowel vloeistof instroom en uitstroom van puin, waardoor het genereren van een steiger die kan worden gebruikt voor eenvoudige cardiale reparatie (bijvoorbeeld als een patch of ventiel steiger) of als een geheel-orgel-steiger.
Introduction
Hartfalen leidt tot een hoge mortaliteit bij patiënten. De ultieme behandelingsoptie voor einde-fase hartfalen is allo-transplantatie. Echter, er is een lange wachtlijst voor transplantatie als gevolg van de tekort van donor-organen, en patiënten gezicht na transplantatie horden variërend van levenslang bij immuunsuppressie tot chronische orgel afwijzing1,2. Bioengineering functionele harten door repopulatie decellularized mens en middelgrote hart met een patiënt eigen cellen kunnen omzeilen deze horden3.
Een belangrijke stap in “engineering” een hart is de oprichting van een steiger met passende vasculaire en parenchymal structuur, de samenstelling en de functie voor het begeleiden van de uitlijning en de organisatie van geleverde cellen. In aanwezigheid van het geschikte kader, moeten cellen uitgezaaid op het schavot herkennen van het milieu en de verwachte functie uitvoeren als onderdeel van dat orgaan. Volgens ons omvat decellularized orgel extracellulaire matrix (dECM) de nodige kenmerken van het ideale schavot.
Door gebruik te maken van intrinsieke therapieën, kan complexe geheel-orgel-decellularization worden bereikt via antegrade of retrograde perfusie4 om te verwijderen van cellulaire componenten met behoud van de gevoelige 3D extracellulaire matrix en therapieën2, 5,6,7. Een functionele therapieën is belangrijk in bioengineering hele organen gewoon zoals het is in vivo, voor nutriënten distributie en afval verwijdering8. Coronaire perfusie decellularization heeft bewezen effectief te zijn in het creëren van decellularized harten van ratten4of varkens4,7,9,10,11 ,12,13, en mensen5,7,14,15,16. Integriteit van de kleppen, atria en andere “thin” regio’s kan echter nadelig beïnvloeden.
Mens-grootte decellularized hart steigers kunnen worden verkregen van varkens met behulp van druk control7,9,10,11,12 of infusie flow rate control13, 17 encontrole van menselijke donoren druk met5,7,14,15. Decellularization van menselijke donor hart doet zich voor meer dan 4-8 dagen onder druk gecontroleerd op 80-100 mmHg in staande oriëntatie5,15,16 of meer dan 16 dagen onder druk gecontroleerd op 60 mmHg14 . Onder antegrade, druk-gecontroleerde decellularization, speelt de bekwaamheid van de aortaklep een cruciale rol bij het handhaven van de efficiëntie van de coronaire perfusie en stabiele druk in de aorta hoofdmap. Onze vorige werk is gebleken dat de richting van het hart invloed op de efficiëntie van de coronaire perfusie tijdens de procedure decellularization en dus de integriteit van de steiger in het einde9.
Als een voortzetting van onze eerdere werk9introduceren we een nieuw concept waarin een hartzakje-achtige zakje is toegevoegd ter verbetering van de gehele-hart decellularization. We beschrijven de decellularization van menselijke harten geplaatst binnen hydrofoor zakjes, omgekeerd georiënteerd, en onder druk gecontroleerd op 120 mmHg bij de aorta wortel. Dit protocol omvat het toezicht op het profiel van de stroom en de verzameling uitstroom media gedurende de decellularization procedure voor de evaluatie van de efficiëntie van de coronaire perfusie en cel puin verwijderen. Biochemische tests worden vervolgens uitgevoerd om te testen van de effectiviteit van de methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om onze kennis is dit de eerste studie verslag omgekeerde decellularization van menselijke harten binnen een hydrofoor etui met time-lapse toezicht op stroom tarief en cel puin verwijderen. Het pericard-achtige zakje houdt de richting van het hart stabiel gedurende de hele procedure decellularization. Inlaten en omkeren van de hele hart binnen een zakje voorkomt uitdroging en minimaliseert overmatige krachten op de aorta (van hart gewicht) wanneer vergeleken met de conventionele rechtop Langendorff perfusie decellulariza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de Houston Endowment grant en de Texas Emerging Technology Fund. De auteurs erkennen de overheidsopdrachten orgel LifeGift, Inc. en van de donor gezinnen om dit onderzoek mogelijk te maken.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
