Descelularización de todo humano corazón dentro de una bolsa presurizada en una orientación invertida
Summary
Este método permite la descelularización de un órgano sólido complejo utilizando un protocolo simple basado en choque osmótico y perfusión de detergente iónico con una interrupción mínima del órgano matriz. Se compone de una técnica de descelularización novela para los corazones humanos dentro de una bolsa presurizada con monitoreo en tiempo real de flujo dinámica y celulares residuos de la salida.
Abstract
La solución definitiva para pacientes con insuficiencia cardiaca de fase final es el trasplante de órganos. Pero corazones de donantes son limitados, inmunosupresión es necesaria y en última instancia puede ocurrir rechazo. Creación de un funcional, corazón bio-artificial autóloga podría resolver estos desafíos. Biofabrication de un corazón de andamio y de las células es una opción. Un andamio natural con composición de tejidos específicos así como micro y macro arquitectura puede obtenerse por decellularizing corazones de seres humanos o animales grandes, como cerdos. Descelularización consiste en lavar los desechos celulares mientras preserva vasculatura y 3D de la matriz extracelular y permitir que “cellularization” en un punto más adelante. Capitalizando nuestra novela encontrar eso descelularización de perfusión de órganos complejos es posible, se desarrolló un método más “fisiológica” para decellularize no transplantable corazones humanos colocándolos dentro de una bolsa a presión, en un invertido orientación, bajo presión controlada. El propósito de usar una bolsa presurizada es crear gradientes de presión a través de la válvula aórtica para mantenerlo cerrado y mejorar la perfusión miocárdica. Evaluación simultánea de la dinámica del flujo y la eliminación de detritos celulares durante la descelularización permitida monitorear flujo líquido y flujo de escombros, generando un andamio que puede ser utilizado tanto para la simple reparación cardiaca (por ejemplo, como un parche o andamio de la válvula) o como un andamio de todo órgano.
Introduction
Insuficiencia cardíaca provoca alta mortalidad en los pacientes. La opción de tratamiento definitivo por insuficiencia de la fase final es el trasplante de allo. Sin embargo, hay una larga lista de espera para el trasplante debido a la escasez de donantes de órganos y pacientes cara poste-trasplante obstáculos que van desde inmunosupresión de por vida a rechazo crónico de órgano1,2. Corazones funcionales Bioingeniería por repoblación decellularized corazones de tamaño humano con un paciente células podrían eludir estos obstáculos3.
Un paso importante en la “ingeniería” un corazón es la creación de un andamio con adecuada estructura vascular y parenquimatosa, composición y función para guiar la alineación y organización de las células entregadas. En presencia del marco adecuado, las células sembradas en el andamio deben reconocer el entorno y realizan la función esperada como parte de ese órgano. En nuestra opinión, matriz extracelular decellularized órgano (dECM) comprende las características necesarias del andamio ideal.
Mediante la utilización de vasculatura intrínseca, complejo descelularización de todo órgano puede lograrse vía anterógrada o retrógrada perfusión4 quitar componentes celulares conservando el delicado 3D matriz extracelular y la vasculatura2, 5,6,7. Una vasculatura funcional es importante en órganos enteros de Bioingeniería justo como es en vivo, para la distribución de nutrientes y eliminación de residuos8. Descelularización de perfusión coronaria ha demostrado para ser eficaz en la creación de decellularized corazones de ratas4o cerdos4,7,9,10,11 ,12,13y los humanos5,7,14,15,16. Sin embargo, puede sufrir integridad de las válvulas, aurículas y otras regiones “finas”.
Corazón decellularized tamaño andamios pueden obtenerse en cerdos usando presión control7,9,10,11,12 o infusión flujo tasa control13, 17 y control de donantes humanos ejerciendo una presión de5,7,14,15. Descelularización de corazón de donante humano ocurre durante 4-8 días bajo presión controlada en 80-100 mmHg en orientación vertical5,15,16 o más de 16 días bajo presión controlada en 60 mmHg14 . Bajo anterógrado, descelularización de presión controlada, la competencia de la válvula aórtica desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la eficacia de la perfusión coronaria y presión estable en la raíz aórtica. Nuestro trabajo anterior reveló que la orientación del corazón influye en su eficacia de la perfusión coronaria durante el procedimiento de descelularización y por lo tanto la integridad del andamio en el final9.
Como continuación de nuestro anterior trabajo9, introducimos un nuevo concepto en donde se agrega una bolsa pericardio-como mejorar la descelularización de todo corazón. Describimos la descelularización de corazones humanos colocados dentro de bolsas a presión, inversamente orientadas y bajo presión controlada a 120 mmHg en la raíz aórtica. Este protocolo incluye el monitoreo del perfil de flujo y colección de los medios de salida durante el procedimiento de descelularización para evaluar la eficacia de la perfusión coronaria y eliminación de desechos celulares. Luego se realizan ensayos bioquímicos para comprobar la eficacia del método.
Protocol
Representative Results
Discussion
A nuestro conocimiento, éste es el primer estudio a descelularización Informe invertida del corazón humano dentro de una bolsa presurizada con control Time-lapse del retiro de escombros célula y tasa de flujo. La bolsa de pericardio-como mantiene la orientación del corazón estable durante todo el procedimiento de descelularización. Sumergir los corazones todo dentro de una bolsa de inversión previene la deshidratación y minimiza la excesiva tensión en la aorta (del peso del corazón) cuando en comparación con …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la concesión de la dotación de Houston y el fondo de tecnología emergente de Texas. Los autores reconocen la Agencia de contratación del órgano LifeGift, Inc. y las familias de los donantes por hacer posible este estudio.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
