Decellularization ters yönde bir basınçlı bir kese içinde bütün insan kalp
Summary
Bu yöntem, decellularization karmaşık bir solid organ ozmotik şok ve perfüzyon en az organ matris bozulma ile iyonik deterjan dayalı basit bir protokol kullanarak sağlar. Gerçek zamanlı akış dinamiği ve hücresel enkaz çıkış izleme ile basınçlı bir kese içinde insan kalpleri bir roman decellularization tekniği oluşmaktadır.
Abstract
Organ nakli son aşama kalp yetmezliği olan hastalar için nihai çözümdür. Ama donör kalp sınırlıdır, immünosupresyon gereklidir ve sonuçta ret oluşabilir. Bir işlev oluşturma, otolog biyo-yapay kalp bu sorunları çözebilir. Biofabrication, iskele ve hücreleri oluşur bir kalp bir seçenektir. Doku özel kompozisyon yanı sıra mikro ve makro mimarisi ile doğal bir iskele insanlar ya da domuz gibi büyük hayvanlar tarafından decellularizing kalpler elde edilebilir. Decellularization ise 3D hücre dışı matriks ve damarlara koruyarak ve “cellularization” daha sonra bir timepoint sağlayan hücresel enkaz yıkama içerir. O perfüzyon decellularization karmaşık organları bulmak bizim romanından büyük harfe çevirmeyi mümkündür, transplantable insan kalpleri bir ters içinde basınçlı bir kese içinde yerleştirerek decellularize için daha fazla bir “fizyolojik” yöntemini geliştirdik Yönlendirme, kontrollü baskı altında. Basınçlı bir kese kullanılmasının amacı kapalı ve miyokard perfüzyon geliştirmek tutmak aort kapak arasında basınç gradyanları oluşturmaktır. Akış dinamiği ve hücresel enkaz kaldırma sırasında bize sıvı giriş akımı ve enkaz çıkış akışı izlemek izin decellularization eşzamanlı değerlendirilmesi, böylece olabilir bir iskele oluşturmak basit kardiyak onarım için kullanılan (Örneğin bir yama olarak veya Vana iskele) veya bir bütün-organ iskele olarak.
Introduction
Yüksek mortalite hastalarda kalp yetmezliği yol açar. Allo-nakli son aşama kalp yetmezliği için nihai tedavi seçeneğidir. Ancak, donör organ sıkıntısı nedeniyle nakli için uzun bir bekleme listesi ve hastalar yüz nakli sonrası ömür boyu immünosupresyon arasında değişen kronik organ ret1,2Engelli. Decellularized insan ölçekli mavi kalpler olan bir hastanın kendi kullanıma tarafından Biyomühendislik fonksiyonel kalp hücreleri bu Engelli3aşmak.
Önemli bir adım “mühendislik”, uygun vasküler ve parenkimal yapısı, kompozisyon ve hizalama kılavuzunu fonksiyonu ile bir iskele oluşturulması ve organizasyon teslim edilen hücre kullanılan bir kalptir. Uygun çerçeve varlığında, iskele üzerinde seribaşı hücreleri çevreyi tanımak ve bu organ bir parçası olarak beklenen işlevi gerçekleştirmek gerekir. Bize göre ideal iskele gerekli özellikleri decellularized organ hücre dışı matriks (dECM) oluşur.
İçsel damarlara kullanarak, karmaşık bütün-organ decellularization antegrade veya hassas 3D hücre dışı matriks ve damarlara2koruyarak hücresel bileşenleri kaldırmak için retrograd perfüzyon4 üzerinden elde edilebilir, 5,6,7. Vivo, besin dağıtım ve atık kaldırma8için olduğu gibi fonksiyonel damarlara Biyomühendislik tüm organlarda sadece önemlidir. Koroner perfüzyon decellularization fareler4veya domuz4,7,9,10,11 decellularized kalpler yaratmada etkili olduğu kanıtlanmıştır ,12,13ve insanlar5,7,14,15,16. Henüz, vanalar, kulakçık ve “ince” diğer bölgeler bütünlüğünü muzdarip olabilir.
İnsan boyutunda decellularized kalp iskele basınç kontrol7,9,10,11,12 veya infüzyon akış hızı Denetim13, kullanarak domuz elde edilebilir 17 ve basınç kullanarak insan bağışçılardan5,7,14,15kontrol. İnsan donör kalplerin decellularization 4-8 gün içinde 80-100 mmHg dik yönlendirme5,15,16 ya da 16 gün boyunca 60 mmHg14 , kontrollü baskı altında kontrollü baskı altında oluşur . Antegrade altında decellularization, basınç kontrollü aort kapak yetkinlik koroner perfüzyon verimlilik ve aortik kökü sabit basınçta korumada önemli bir rol oynar. Önceki çalışmalarımız kalp yönünü decellularization yordam ve bu nedenle iskele bütünlük içinde son9sırasında koroner perfüzyon verimliliğini etkiler ortaya koydu.
Bizim önceki iş9devamı olarak, biz bütün-kalp decellularization geliştirmek için bir kalp zarını benzeri kese onda eklendi bir roman kavramı tanıtmak. Biz ters odaklı, basınçlı torbalar içinde ve aortik kök 120 mmHg, kontrollü baskı altında yerleştirilen insan gönül decellularization açıklar. Bu iletişim kuralı akışı profil ve koroner perfüzyon verimliliği ve hücre enkaz kaldırma değerlendirmek için decellularization yordam boyunca dışa akış ortamlarının topluluğu izleme içerir. Biyokimyasal deneyleri sonra yönteminin etkinliğini test etmek için gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bilgimizi, akış hızı ve hücre enkaz kaldırma zaman hata izleme ile ters rapor decellularization basınçlı bir kese içinde insan gönül için ilk çalışmadır. Kalp zarını benzeri kese kalp yönünü decellularization yordam sabit tutar. Batış ve tüm kalpleri bir kese içinde ters çevirme dehidratasyon engeller ve aort (dan kalp ağırlık) üzerinde aşırı yük ne zaman en aza indirir geleneksel dik Langendorff perfüzyon decellularization Yöntem9‘ a göre. Bu, sırayla, aort …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Houston bağış hibe ve Texas gelişmekte olan teknoloji Fonu tarafından desteklenmiştir. Organ tedarik ajansı yazarlar kabul LifeGift, Inc. ve vericinin aileler bu çalışma mümkün yapmak için.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
