एक उल्टे अभिविंयास में एक दबाव थैली के अंदर पूरे मानव दिल की Decellularization
Summary
इस विधि में सक्षम बनाता है एक जटिल ठोस अंग का उपयोग कर एक सरल आसमाटिक सदमे के आधार पर प्रोटोकॉल और ईओण डिटर्जेंट के छिड़काव ंयूनतम अंग मैट्रिक्स व्यवधान के साथ । यह प्रवाह गतिशीलता और सेलुलर मलबे बहिर्वाह की वास्तविक समय की निगरानी के साथ एक दबाव थैली के अंदर मानव दिलों के लिए एक उपंयास decellularization तकनीक शामिल हैं ।
Abstract
अंतिम चरण के दिल की विफलता के साथ रोगियों के लिए परम समाधान अंग प्रत्यारोपण है । लेकिन दाता दिल सीमित हैं, प्रतिरक्षादमन की आवश्यकता है, और अंततः अस्वीकृति हो सकता है । एक कार्यात्मक, ऑटोलॉगस जैव कृत्रिम दिल बनाने इन चुनौतियों का समाधान हो सकता है । पाड़ और कोशिकाओं के शामिल एक दिल का एक विकल्प है । ऊतक के साथ एक प्राकृतिक पाड़ विशिष्ट संरचना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सूक्ष्म और स्थूल वास्तुकला मनुष्यों या सूअरों जैसे बड़े जानवरों से decellularizing दिल से प्राप्त किया जा सकता है । Decellularization 3 डी extracellular मैट्रिक्स और vasculature के संरक्षण और एक बाद में timepoint पर “cellularization” की अनुमति, जबकि सेलुलर मलबे धोने शामिल है । हमारे उपंयास को खोजने कि जटिल अंगों के छिड़काव decellularization संभव है पर कैपिटल, हम एक अधिक “शारीरिक” विधि विकसित करने के लिए उंहें एक दबाव थैली के अंदर रखकर गैर प्रत्यारोपण मानव दिल decellularize, एक औंधा में अभिविन्यास, नियंत्रित दबाव के तहत. एक दबाव थैली का उपयोग करने के प्रयोजन के लिए यह बंद रखने और रोधगलन छिड़काव में सुधार करने के लिए महाधमनी वाल्व के पार दाब ढाल बनाने के लिए है । decellularization के दौरान प्रवाह गतिशीलता और सेलुलर मलबे हटाने के एक साथ आकलन हमें दोनों द्रव बहिर्वाह और मलबे बहिर्वाह पर नजर रखने के लिए अनुमति दी है, जिससे एक पाड़ है कि या तो सरल हृदय की मरंमत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पैदा (जैसे एक पैच या वाल्व पाड़) या एक पूरे अंग पाड़ के रूप में ।
Introduction
दिल की विफलता रोगियों में उच्च मृत्यु की ओर जाता है । अंतिम चरण के दिल की विफलता के लिए परम उपचार विकल्प एलो-ट्रांसप्लांटेशन है । हालांकि, दाता अंगों की कमी के कारण प्रत्यारोपण के लिए एक लंबी प्रतीक्षा सूची है, और रोगियों के बाद प्रत्यारोपण बाधाओं का सामना करना है कि जीवन से लेकर लंबे समय तक प्रतिरक्षादमन जीर्ण अंग अस्वीकृति1,2। एक रोगी की खुद की कोशिकाओं के साथ मानव-आकार के दिलों को बसाने के द्वारा इंजीनियरिंग कार्यात्मक दिल इन बाधाओं3दरकिनार सकता है ।
“इंजीनियरिंग” एक दिल में एक प्रमुख कदम उचित नाड़ी और parenchymal संरचना, रचना और समारोह के साथ एक पाड़ के निर्माण के लिए संरेखण और वितरित कोशिकाओं के संगठन का मार्गदर्शन है । उचित ढांचे की उपस्थिति में, मचान पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को पर्यावरण की पहचान और उस अंग के भाग के रूप में अपेक्षित समारोह प्रदर्शन करना चाहिए । हमारी राय में, सेलुलर अंग extracellular मैट्रिक्स (dECM) आदर्श पाड़ की आवश्यक विशेषताओं शामिल हैं ।
आंतरिक vasculature का उपयोग करके, जटिल पूरे अंग decellularization नाजुक 3 डी extracellular मैट्रिक्स और vasculature2के संरक्षण, जबकि सेलुलर घटकों को दूर करने के लिए antegrade या प्रतिगामी छिड़काव4 के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, 5,6,7. एक कार्यात्मक vasculature इंजीनियरिंग पूरे अंगों में महत्वपूर्ण है बस के रूप में यह vivo मेंहै, पोषक तत्व वितरण और अपशिष्ट हटाने8के लिए । कोरोनरी छिड़काव decellularization चूहों4, या सूअरों से सेलुलर दिल बनाने में प्रभावी साबित किया गया है4,7,9,10,11 ,12,13, और मनुष्यों5,7,14,15,16। फिर भी, वाल्व, atria और अंय “पतली” क्षेत्रों की अखंडता पीड़ित कर सकते हैं ।
मानव आकार के हृदय पाड़ों दबाव नियंत्रण का उपयोग कर सूअरों से प्राप्त किया जासकता 7,9,10,11,12 या अर्की प्रवाह दर नियंत्रण13, 17 और मानव दाताओं से दबाव नियंत्रण5,7,14,15का उपयोग कर । मानव दाता दिलों की Decellularization दबाव में 80-100 mmHg पर नियंत्रण के तहत 4-8 दिनों में ईमानदार अभिविन्यास5,15,16 या दबाव के तहत 16 दिनों में ६० mmHg14 पर नियंत्रित होता है . antegrade, दबाव नियंत्रित decellularization के तहत, महाधमनी वाल्व क्षमता महाधमनी रूट पर कोरोनरी छिड़काव दक्षता और स्थिर दबाव को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हमारे पिछले काम से पता चला है कि दिल के उंमुखीकरण decellularization प्रक्रिया के दौरान अपनी कोरोनरी छिड़काव दक्षता और इसलिए9अंत में पाड़ अखंडता को प्रभावित करता है ।
हमारे पिछले9काम के एक निरंतरता के रूप में, हम एक उपंयास अवधारणा जिसमें एक पेरीकार्डियम-पाउच की तरह पूरे दिल decellularization में सुधार जोड़ा है परिचय । हम दबाव पाउच के अंदर रखा मानव दिल के decellularization का वर्णन, व्युत्क्रम उंमुख, और महाधमनी रूट पर १२० mmHg पर नियंत्रण के तहत दवाब । इस प्रोटोकॉल decellularization प्रक्रिया भर में प्रवाह प्रोफ़ाइल और बहिर्वाह मीडिया के संग्रह की निगरानी के लिए कोरोनरी छिड़काव दक्षता और कोशिका मलबे हटाने का मूल्यांकन भी शामिल है । जैव रासायनिक परख तो विधि की प्रभावशीलता का परीक्षण किया जाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली अध्ययन के लिए समय के साथ एक दबाव थैली के भीतर मानव दिल के उल्टे decellularization रिपोर्ट प्रवाह की दर और सेल मलबे हटाने की निगरानी । पेरीकार्डियम थैली की तरह decellularization प्रक्रिया भर में स्थि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अनुसंधान ह्यूस्टन बंदोबस्ती अनुदान और टेक्सास उभरते प्रौद्योगिकी कोष द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक इस अध्ययन संभव बनाने के लिए अंग खरीद एजेंसी LifeGift, Inc और दाता परिवारों को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
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