Decellularization av hele hjerte inne i en trykksatt pose i en omvendt retning
Summary
Denne metoden gjør det mulig for decellularization av en kompleks solid organ bruker en enkel protokoll basert på osmotisk sjokk og perfusjon over ionisk vaskemiddel med minimal orgel matrix avbrudd. Det består av en roman decellularization teknikk for menneskenes hjerter inne i en trykksatt pose med real-time overvåkning av flyt dynamikk og mobilnettet rusk utløp.
Abstract
Den ultimate løsningen for pasienter med sluttstadiet hjertesvikt er transplantasjon. Men donor hjerter er begrenset, immunsuppresjon kreves, og til slutt avvisning kan oppstå. Oppretter en funksjonell, kan autologous bio-kunstig hjerte løse disse utfordringene. Biofabrication av et hjerte består av stillaset og celler er ett alternativ. En naturlig stillaset vev-spesifikke sammensetning i tillegg til mikro – og makro-arkitektur kan fås ved decellularizing hjerter fra mennesker eller store dyr som griser. Decellularization innebærer vaske ut mobilnettet rusk samtidig bevare 3D ekstracellulær matrix og blodkar og slik at “cellularization” på en senere timepoint. Utnytte vår romanen finne at perfusjon decellularization komplekse organer er mulig, vi utviklet en mer “fysiologiske” metode for å decellularize ikke-transplantable menneskenes hjerter ved å plassere dem inne i en trykksatt pose, i en omvendt orientering, kontrollert presset. Hensikten med å bruke en trykksatt pose er å skape press graderinger over Aortaklaff å oppbevare den stengt og forbedre hjerteinfarkt perfusjon. Samtidige vurdering av flyt dynamikk og mobilnettet rusk fjerning under decellularization tillatt oss å overvåke både væske tilsig og rusk utløp, og dermed generere et stillas som kan brukes for enkle cellebiologi (f.eks som en patch eller ventilen stillas) eller som en hel-orgel stillaset.
Introduction
Hjertesvikt fører til høy dødelighet hos pasienter. Den ultimate behandling for sluttstadiet hjertesvikt er allo-transplantasjon. Men det er en lang vent-liste for transplantasjon på grunn av mangel på donor organer, og pasienter ansiktet etter transplantasjon hindringer som spenner fra livslang immunsuppresjon kronisk orgel avvisning1,2. Bioteknologi funksjonelle hjerter ved repopulating decellularized menneske-størrelse hjerter med pasientens egen celler kan omgå disse hindrene3.
Et stort skritt i “engineering” et hjerte er etableringen av et stillas med passende vaskulær og parenchymal struktur, komposisjon og å veilede justeringen og leverte cellenes. I nærvær av riktige rammen, skal celler seeded på skafottet gjenkjenne miljøet og utføre funksjonen forventet som en del av dette organ. Etter vår mening decellularized orgel ekstracellulær matrix (dECM) består av nødvendig karakteristikkene av ideelle stillaset.
Ved å benytte iboende blodkar, kan komplekse hele-orgel decellularization oppnås via antegrade eller retrograd perfusjon4 fjerne cellulære komponenter samtidig bevare den delikate 3D ekstracellulær matrix og blodkar2, 5,6,7. En funksjonell blodkar er viktig i bioteknologi hele organer bare som i vivo, for næringsstoffer distribusjon og fjerning8. Koronar perfusjon decellularization har vist seg for å være effektive i å skape decellularized hjerter fra rotter4eller griser4,7,9,10,11 ,12,13, og mennesker,5,,7,,14,,15,,16. Likevel, ventiler, atria og andre “tynn” regioner kan lide.
Menneske-størrelse decellularized hjertet stillaser kan fås fra griser bruker trykk kontroll7,9,10,11,12 eller infusjon flow rate kontroll13, 17 og fra menneskelige givere bruker press5,7,14,15. Decellularization menneskelig donor hjerter oppstår over 4-8 dager under press kontrollert på 80-100 mmHg i stående retning5,15,16 eller over 16 dager under press kontrollerte 60 mmHg14 . Under antegrade, trykk-kontrollerte decellularization, spiller Aortaklaff kompetansen en avgjørende rolle i å opprettholde koronar perfusjon effektivitet og stabilt trykk aorta roten. Tidligere arbeidet avslørte at retningen på hjertet påvirker effektiviteten koronar perfusjon under decellularization prosedyren og derfor stillaset integriteten i slutten9.
Som en fortsettelse av våre tidligere arbeid9introduserer vi en roman konsept der en pericardium som pose er lagt til forbedre hele-hjertet decellularization. Vi beskrive decellularization av menneskenes hjerter plassert innenfor trykksatt poser, omvendt orientert, og under press kontrollert på 120 mmHg aorta roten. Denne protokollen omfatter overvåking flyt profil og samling av utløp media hele prosedyren for decellularization å vurdere koronar perfusjon effektivitet og celle rusk fjerning. Biokjemiske analyser utføres da for å teste effektiviteten av metoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi vet er dette den første studien å rapportere invertert decellularization av menneskenes hjerter inne i en trykksatt pose med time-lapse overvåking av flow rate og celle rusk fjerning. Den pericardium som posen holder retningen på hjertet stabilt gjennom decellularization prosedyren. Submerging og snu hele hjerter i en pose forhindrer dehydrering og minimerer overdreven belastning på aorta (fra hjertet vekt) når sammenlignet med konvensjonelle oppreist Langendorff perfusjon decellularization metode<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av Houston legat stipendet og Texas Emerging Technology Fund. Forfatterne bekrefter orgel innkjøp byrået LifeGift, Inc. og donor familier for å gjøre denne studien mulig.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
