Decellularizzazione di cuore umano intero all'interno di una custodia pressurizzata in un orientamento invertito
Summary
Questo metodo consente di decellularizzazione di un organo solido complesso utilizzando un semplice protocollo basato su shock osmotico e l’aspersione di detergente ionico con rottura di matrice minimal organo. Si compone di una tecnica di decellularizzazione romanzo per cuori umani all’interno di una custodia pressurizzata con monitoraggio in tempo reale del deflusso di detriti cellulari e dinamiche flusso.
Abstract
La soluzione definitiva per i pazienti con infarto di stadio finale è il trapianto d’organo. Ma cuori erogatori sono limitati, l’immunosoppressione è necessaria e in ultima analisi, può verificarsi il rifiuto. Creazione di un funzionale, cuore bio-artificiale autologo potrebbe risolvere queste sfide. Biofabrication di un cuore composto da impalcatura e cellule è un’opzione. Un’impalcatura naturale con composizione tessuto-specifici, come pure micro – e macro-architettura possa essere reperita da cuori decellularizing esseri umani o animali di grandi dimensioni come i maiali. Decellularizzazione prevede il lavaggio fuori detriti cellulari preservando la vascolarizzazione e 3D matrice extracellulare e permettendo di “cellularization” ad un determinato timepoint successivo. Capitalizzando sulla nostra individuazione che decellularizzazione di perfusione degli organi complessi del romanzo è possibile, abbiamo sviluppato un metodo più “fisiologico” per decellularize cuori umani non trapiantabili inserendoli all’interno di una custodia pressurizzata, in un invertito orientamento, sotto pressione controllata. Lo scopo di utilizzare una custodia pressurizzata è quello di creare gradienti di pressione attraverso la valvola aortica a tenerlo chiuso e migliorare la perfusione del miocardio. Valutazione simultanea della dinamica dei flussi e la rimozione di detriti cellulari durante decellularizzazione ci ha permesso di monitorare sia fluido afflusso e deflusso di detriti, generando così un’impalcatura che può essere utilizzato sia per la semplice riparazione cardiaca (ad es. come una patch o impalcatura di valvola) o come un’impalcatura di tutto-organo.
Introduction
Insufficienza cardiaca conduce ad alto tasso di mortalità nei pazienti. L’opzione di trattamento finale per infarto di stadio finale è allo-trapianto. Tuttavia, c’è una lunga lista d’attesa per trapianto a causa della scarsità di donatori di organi e pazienti viso post-trapianto ostacoli che vanno da tutta la vita immunosoppressione cronica organo rifiuto1,,2. Il cuore funzionale Bioingegneria di ripopolare decellularizzati cuori di dimensioni umane con un propria del paziente cellule potrebbero aggirare questi ostacoli3.
Un importante passo in “ingegneria” un cuore è la creazione di un’impalcatura con adeguata struttura vascolare e parenchima, la composizione e la funzione di guidare l’allineamento e l’organizzazione delle cellule consegnate. In presenza del quadro appropriato, cellule seminate sul patibolo dovrebbero riconoscere l’ambiente e svolgere la funzione prevista come parte di quell’organo. A nostro parere, matrice extracellulare organo decellularizzati (dECM) comprende le caratteristiche necessarie dell’impalcatura ideale.
Utilizzando il sistema vascolare intrinseco, complesso intero-organo decellularizzazione può essere raggiunto via anterograda o aspersione retrograda4 per rimuovere componenti cellulari, preservando la matrice extracellulare 3D delicata e sistema vascolare2, 5,6,7. Un funzionale sistema vascolare è importante in organi interi di Bioingegneria soli quanto è in vivo, per la distribuzione dei nutrienti e la rimozione dei rifiuti8. Decellularizzazione di perfusione coronarica ha dimostrato di essere efficace nella creazione di decellularizzazione cuori da ratti4, o maiali4,7,9,10,11 ,12,13e gli esseri umani5,7,14,15,16. Ancora, può soffrire l’integrità delle valvole, atri e altre regioni “sottile”.
Umani-dimensione decellularizzati cuore ponteggi possono essere ottenuti da suini usando pressione controllo7,9,10,11,12 o infusione flusso frequenza controllo13, 17 e da donatori umani usando pressione controllo5,7,14,15. Decellularizzazione di cuori di donatori umani si verifica oltre il 4-8 giorni sotto pressione controllata a 80-100 mmHg in orientamento verticale5,15,16 o oltre 16 giorni sotto pressione controllata a 60 mmHg14 . Sotto antegrade, pressione controllata decellularizzazione, la competenza della valvola aortica svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della perfusione coronarica efficienza e pressione stabile alla radice aortica. Il nostro lavoro precedente ha rivelato che l’orientamento del cuore influenza l’efficienza di perfusione coronarica durante la procedura di decellularizzazione e pertanto l’integrità dell’impalcatura nel fine9.
Come una continuazione del nostro precedente lavoro9, introduciamo un nuovo concetto in cui un sacchetto di pericardio-come è aggiunto per migliorare tutto-cuore decellularizzati. Descriviamo il decellularizzazione di cuori umani disposti all’interno di sacchetti pressurizzati, inversamente orientati e sotto pressione controllata a 120 mmHg nella radice aortica. Questo protocollo include il monitoraggio del profilo di flusso e collezione di media di deflusso durante tutta la procedura di decellularizzazione per valutare l’efficienza di perfusione coronarica e rimozione detriti cellulari. Analisi biochimiche sono poi eseguite per testare l’efficacia del metodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A nostra conoscenza, questo è il primo studio di decellularizzazione relazione invertita dei cuori umani all’interno di una custodia pressurizzata con monitoraggio time-lapse di rimozione di detriti di tasso e cella di flusso. Il sacchetto di pericardio-come mantiene l’orientamento del cuore stabile durante tutta la procedura di decellularizzazione. Sommergendo e invertendo i cuori interi all’interno di un sacchetto previene la disidratazione e riduce al minimo sforzo eccessivo sull’aorta (dal peso del cuore) quando con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dalla concessione di Houston Endowment e il Texas Emerging Technology Fund. Gli autori riconoscono l’agenzia di approvvigionamento dell’organo LifeGift, Inc e famiglie del donatore per aver reso possibile questo studio.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
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