Summary

Высокая производительность жидкостной хроматографии измерение Кинуренин и Кинуреновая кислота: касающиеся биохимии познания и сна у крыс

Published: August 19, 2018
doi:

Summary

Изменения в нейроактивный метаболитов Кинуренин путь (КП) вовлечены в психиатрических болезней. Расследование функциональные результаты изменены Кинуренин путь метаболизма в естественных условиях в грызунов может помочь прояснить новые терапевтические подходы. Текущий протокол сочетает в себе биохимических и поведенческих подходов для изучения последствий острых Кинуренин вызова крыс.

Abstract

Кинуренин путь (КП) триптофан деградации были причастны психических расстройств. В частности, экзоцитоз производные метаболит Кинуреновая кислота (KYNA), антагонист на обоих N-метил-d-аспартат (NMDA) и рецепторов α7 никотиновых ацетилхолиновых (α7nACh), был вовлечен в когнитивных процессов в здоровье и болезни. Как KYNA уровни повышаются в мозгах пациентов с шизофренией, неисправности на глутаматергические и холинергических рецепторов считается каузально связаны с когнитивной дисфункции, основной домен психопатологии болезни. KYNA могут играть pathophysiologically важную роль в людей с шизофренией. Это позволяет поднять эндогенного KYNA грызунов мозга, лечение животных с прямой bioprecursor Кинуренин, и доклинические исследования на крысах показали, что острый фасады в КИНА могут влиять на процессы обучения и памяти. Текущий протокол описывает этот экспериментальный подход в деталях и сочетает) биохимический анализ крови Кинуренин и мозг формирования КИНА (с помощью высокой производительности жидкостной хроматографии), b) поведенческое тестирование зонда гиппокампа зависимых контекстной памяти (пассивный избежания парадигмы) и c) Оценка поведения сон бодрствование [телеметрической записей, сочетание электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и сигналы электромиограммы (ЭМГ)] в крыс. Взятые вместе, изучается связь между повышенной КИНА, сна и познание, и этот протокол описывает подробно экспериментальный подход к пониманию результатов функции высоты Кинуренин и KYNA образование в естественных условиях в крыс. Результаты, полученные через вариации этого протокола будет проверить гипотезу, что КП и KYNA выполнять ключевую роль в модуляции сна и познания в здоровье и болезни Штатах.

Introduction

КП отвечает за унижающего достоинство почти 95% незаменимые аминокислоты триптофан1. В мозге млекопитающих Кинуренин в астроциты метаболизируется в малые молекулы нейроактивный КИНА главным образом фермента Кинуренин (АЛТ) (кат) II2. KYNA действует как антагонист на NMDA и α7nACh рецепторы в мозге2,3,4, и также целей сигнализации рецепторов, включая арил углеводородов рецептор (ААР) и G-белок сочетании рецептор 35 (GPR35)5 ,6. В экспериментальных животных фасады в мозге КИНА показали бы нарушить их когнитивных функций в массив поведенческих анализы2,,78,9,10 . Новые гипотеза предполагает, что КИНА играет важную роль в модуляции когнитивные функции, влияющие на поведение сна11, таким образом дальнейшей поддержки роли экзоцитоз производные молекул в модуляции нейробиологии сна и Познание12.

Клинически фасады в KYNA были найдены в спинномозговой жидкости и посмертные мозговой ткани от пациентов с шизофренией13,14,,1516, изнурительных психическое расстройство характеризуется когнитивные расстройства. Пациентов с шизофренией также часто страдают от расстройства сна, которые могут усугубить болезнь17. Понимание роли КП метаболизма и KYNA в модуляции отношения между сна и познания, особенно между учить и память, могут привести к развитию Роман терапии для лечения этих неблагоприятных исходов в шизофрении и других психические заболевания.

Надежного и последовательного метода для измерения КП метаболитов важно заверить, что исследования, выходящих из различных учреждений могут быть интегрированы в научное понимание биологии КП. В настоящее время мы описываем методологии оценки Кинуренин в плазме крови крыс и KYNA в мозге крыс высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Настоящий Протокол, который делает использование обнаружения Флуориметрическое присутствии Zn2 +, был впервые разработан Сибата18 и более недавно адаптирована и оптимизирована для derivatize с 500 мм ацетат цинка как реагент после столбца, позволяющие Обнаружение эндогенные, наномолярных количество КИНА в мозг11.

Чтобы стимулировать выработку эндогенного KYNA de novo , как описано в настоящем Протоколе, прямой bioprecursor Кинуренин вводили внутрибрюшинно (и.п.) у крыс. В сочетании с биохимической оценки для определения степени KYNA производства воздействия Кинуренин вызов памяти гиппокампа зависимые (пассивный избежания парадигмы) и архитектура сон бодрствование (сигналы ЭЭГ и ЭМГ) также исследованы11. Сочетание этих методов позволяет для исследования биохимических и функциональных последствий Кинуренин вызов в естественных условиях в крыс.

Protocol

Наши экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом использования и университета штата Мэриленд институционального ухода за животными и последовал за национальные институты здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных. Примечан?…

Representative Results

Чтобы проверить использование внутрибрюшинного Кинуренин инъекции как метод поднять мозга КИНА, был проведен анализ ВЭЖХ ткани. Стандартные кривые (рис. 1) были построены с использованием соответствующего программного обеспечения и для количественно…

Discussion

Для надежной оценки КИНА в мозге после периферических Кинуренин администрации важно сочетать и интерпретировать биохимических и функциональных экспериментов. Здесь мы представляем подробный протокол, который позволяет новым пользователям устанавливать эффективные методы для изме?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Настоящее исследование было частично финансируется национальных институтов здравоохранения (R01 NS102209) и пожертвование от Клэр E. Форбс доверять.

Materials

Wistar rats Charles River Laboratories adult male, 250-350 g
L-kynurenine sulfate Sai Advantium
ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) Dr. Maisch GmbH
EZ Clips Stoelting Co. 59022
Mounting materials screws PlasticsOne 00-96 X 1/16
Nonabsorbable Sutures MedRep Express 699B CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12
Absorbable Sutures Ethicon J310H 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1
Dental Cement Stoelting Co. 51458
Drill Bit Stoelting Co. 514551 0.45 mm
Name Company Catalog Number Comments
Alliance HPLC system
E2695 separation module Waters 176269503
2475 fluorescence detector Waters 186247500
post-column reagent manager Waters 725000556
Lenovo computer Waters 668000249
Empower software Waters 176706100
Name Company Catalog Number Comments
Passive avoidance box for rat
Extra tall MDF sound attenuating cubicle MedAssociates ENV-018MD Interior: 22"W x 22"H x 16"D
Center channel modulator shuttle box chamber MedAssociates ENV-010MC
Stainless steel grid floor for rat MedAssociates ENV-010MB-GF
Auto guillotine door MedAssociates ENV-010B-S
Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat MedAssociates ENV-010MB-QD
Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel MedAssociates ENV-221M
Sonalert module with volume control for rat chamber MedAssociates ENV-223AM
SmartCtrl 8 input/16 output package MedAssociates DIG-716P2
8 Channel IR control for shuttle boxes MedAssociates ENV-253C
Infrared source and dectector array strips MedAssociates ENV-256
Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080C
Dual range constant current aversive stimulation module MedAssociates ENV-410B
Solid state grid floor scrambler module MedAssociates ENV-412
Dual A/B shock control module MedAssociates ENV-415
2' 3-Pin mini-molex extension MedAssociates SG-216A-2
10' Shock output cable, DB-9 M/F MedAssociates SG-219G-10
Shuttle shock control cable 15', 6 MedAssociates SG-219SA
Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz MedAssociates SG-6080D
PCI interface package MedAssociates DIG-700P2-R2
Shuttle box avoidance utility package MedAssociates SOF-700RA-7
Name Company Catalog Number Comments
Sleep-Wake Monitoring Equipment
Ponehmah software Data Sciences International (DSI) PNP-P3P-610
MX2 8 Source Acquisition interface Data Sciences International (DSI) PNM-P3P-MX204
Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit Data Sciences International (DSI) 271-0112-013
Dell 19" computer monitor Data Sciences International (DSI) 271-0113-001
Receivers for plastic cages, 8x Data Sciences International (DSI) 272-6001-001
Cisco RV130 VPN router Data Sciences International (DSI) RV130
Matrix 2.0 Data Sciences International (DSI) 271-0119-001
Network switch Data Sciences International (DSI) SG200-08P
Neuroscore software Data Sciences International (DSI) 271-0171-CFG
Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET Data Sciences International (DSI) 270-0134-001

References

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R., Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia – From Molecules to Behavior. , 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

Play Video

Cite This Article
Baratta, A. M., Viechweg, S. S., Mong, J. A., Pocivavsek, A. A High-performance Liquid Chromatography Measurement of Kynurenine and Kynurenic Acid: Relating Biochemistry to Cognition and Sleep in Rats. J. Vis. Exp. (138), e58129, doi:10.3791/58129 (2018).

View Video