Kynurenine 및 Kynurenic 산의 고성능 액체 크로마토그래피 측정: 생화학 인식 및 쥐에 수 면에 관한
Summary
Kynurenine 통로 (KP) neuroactive metabolites 변경 정신 질병에 연루 됩니다. 변경 된 kynurenine 통로 신진 대사에서 vivo에서 설치류에서의 기능적인 결과 조사 하 고 새로운 치료 접근을 명료 하 게 하는 것을 도울 수 있다. 현재 프로토콜 쥐에 심각한 kynurenine 도전의 영향을 조사 하기 위해 생 화 학적 및 행동 접근을 결합 합니다.
Abstract
트립토판 저하의 kynurenine 통로 (KP) 정신 장애에 연루 되었습니다. 특히, 사이토 파생 된 대사 산물 kynurenic 산 (KYNA), 두 N에 적-메 틸-d-aspartate (NMDA)와 α7 nicotinic 아 세 틸 콜린 (α7nACh) 수용 체, 건강과 질병에 있는 인지 과정에 연루 되어 있다. KYNA 레벨은 정신 분열 증을 가진 환자의 두뇌에서 상승로 glutamatergic 및 해 수용 체에서 오작동 인지 기능 장애, 질병의 병리학의 핵심 도메인 관련 원인이 될 여겨진다. KYNA는 정신 분열 증을 가진 개인에서 pathophysiologically 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 그것은 직접 bioprecursor kynurenine와 동물을 치료 하 여 설치류 두뇌에 내 인 성 KYNA 상승 수 그리고 쥐에 전 임상 연구는 급성 고도 KYNA에 그들의 학습 및 메모리 프로세스 영향을 미칠 수 증명. 현재 프로토콜이 실험 방법을 자세히 설명 하 고 혈액 kynurenine 수준 및 뇌 KYNA 형성 (를 사용 하 여 고성능 액체 크로마토그래피), a)는 생 화 확 적인 분석을 결합 하 여 b) 행동 테스트를 조사 하는 hippocampal 종속 컨텍스트 메모리 (수동 회피 패러다임), 그리고 c) 수 면-각 성 행동 [뇌 파 (EEG)와 치십시오 (EMG) 신호를 결합 하는 telemetric 녹음]의 평가 쥐에서. 함께 찍은, 높은 KYNA, 수 면, 그리고 인식 사이의 관계를 공부 했다, 그리고이 프로토콜 kynurenine 상승 및 KYNA 형성에서 vivo에서 쥐에서의 함수 결과 이해 하는 실험적인 접근 방식을 자세하게에서 설명 합니다. 이 프로토콜의 변화를 통해 얻은 결과 KP와 KYNA 수 면과 건강 및 질병 상태에서 인식 변조에 중추적인 역할을 봉사 하는 가설을 테스트 합니다.
Introduction
KP는 필수 아미노산 트립토판1의 거의 95% 저하 합니다. 포유류 두뇌에서 kynurenine 이다로 효소 kynurenine aminotransferase (KAT) II2로 주로 neuroactive 작은 분자 KYNA에 대사입니다. KYNA 뇌2,3,4, α7nACh와 NMDA 수용 체에 길 항 근으로 작동 하 고 또한 대상 aryl 탄화수소 수용 체 (a h R) 등 G-단백질 수용 체 신호 결합 수용 체 35 (GPR35)5 ,6. 실험 동물에서 뇌 KYNA 고도 행동 분석 실험2,7,8,,910 의 그들의 인지에 관한 퍼포먼스를 손상 표시 되었습니다. . 신흥 가설 제안 KYNA 따라서 변조 수 면의 신경 생물학에서에 더 사이토 파생 분자의 역할을 지 원하는 수 면-각 성 동작11, 영향에 의해 인지 기능 조절에 필수적인 역할 재생 및 인식12.
임상, KYNA 고도 발견 되었습니다 척수 및 사후 뇌 조직에서 정신 분열 증13,,1415,16, 쇠 약 정신 장애를 가진 환자에서 인지 장애가 특징. 정신 분열 증 환자는 또한 종종 병17을 악화 수 있습니다 수 면 방해에 의해 괴 롭 혀. 이 불 쌍 한 결과 정신 분열 증 및 다른 치료에 대 한 새로운 치료의 발전으로 이어질 수 있습니다 변조 수 면과 인식, 학습 및 메모리, 사이 특히 관계에 KP 신진 대사와 KYNA의 역할을 이해 정신과 질병
KP 대사 산물의 측정에 대 한 안정적이 고 일관 된 방법을 다양 한 기관에서 신흥 연구 KP 생물학의 과학적 이해에 통합 될 수을 보장 하기 위해서 중요 하다. 현재, 우리는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 쥐 플라스마에서 kynurenine 및 쥐 두뇌에 있는 KYNA를 측정 하는 방법론을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 만드는 존재 Zn2 +fluorimetric 검색의 사용, 시바타18 등 최근 적응 하 고 허용 후 열 시 약으로 500 m m 아연 아세테이트와 derivatize을 최적화 된에 의해 처음 개발 되었다 생, nanomolar 양의 KYNA 뇌11탐지 합니다.
현재 프로토콜에 설명 된 대로 드 노 보 생 KYNA 생산을 자극, 직접적인 bioprecursor kynurenine intraperitoneally 주입 (i.p.) 쥐에서. KYNA 생산의 정도 확인 하는 생 화 확 적인 평가 함께, hippocampal 종속 메모리 (수동 회피 패러다임)에 도전 하는 kynurenine의 영향 및 수 면-각 성 건축 (EEG 및 EMG 신호) 이기도 조사11. 이러한 기술 조합은 kynurenine 도전에서 vivo에서 쥐에서의 생 화 학적 및 기능적 영향의 연구에 대 한 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
주변 kynurenine 관리 후 두뇌에 있는 KYNA의 신뢰할 수 있는 평가, 결합 하 고 생 화 학적 및 기능 실험 해석 중요 하다. 여기, 우리는 새로운 사용자가 플라즈마 kynurenine 및 KYNA 쥐의 뇌를 측정 하기 위한 효과적인 방법을 설정 하도록 허용 하는 상세한 프로토콜 제시. 플라스마에 kynurenine의 측정 확인 정확한 주입 및 KYNA 대사 산물의 측정 확인 두뇌에 de novo 종합. 설명된 fluorometric HPLC 방법에 맞?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현재 학문 건강의 국가 학회 (R01 NS102209)와 클레어 E. 포브스 신뢰에서 기부금에 의해 부분적으로 투자 되었다.
Materials
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22"W x 22"H x 16"D |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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