조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Summary

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

Abstract

형성 증후군 (MDS) 효과 조, 말 초 혈액 cytopenias, 발육 이상, 급성 백혈병에 변환에 대 한 성향에 의해 정의 되는 조 혈 줄기 세포 장애의 다양 한 그룹입니다. NUP98-HOXD13 (NHD13) 유전자 변형 마우스 주변 혈액 cytopenias, 발육 이상, 및 급성 백혈병 변환 인적 MDS 정리. 우리는 이전는 MDS 옮겨질 수 있었다 MDS와 유전자 조작된 마우스에서 야생-타입 받는 사람에 게 이식 MDS 골 nucleated 세포 (BMNC)에 의해 설명 했다. 더 명확 하 게 근원의 MDS 셀 이해, 특정 이식 하는 방법을 개발 했습니다, 그리고 immunophenotypically 조 혈 하위 집합을 정의 합니다. 이 문서에서 우리는 분리 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 특정 인구를 이식 하는 과정을 설명 합니다. 따라 이식, 이식의 효율성 및 기증자 MDS 셀의 지 속성을 평가 하는 방법 설명 합니다.

Introduction

형성 증후군 (MDS) 대표 클론 혈액 장애 효과 조, 발육 이상의 morphologic 증거 및 급성 골수성 백혈병 (AML)^{1,2로 변환에 대 한 성향 특징의 다양 한 세트 ,,34}. 효과 조 골 수에서 성숙 체포 및 hypercellular 골^1,3에 불구 하 고 주변 혈액 cytopenias 결과 인식 됩니다. MDS의 발병 률 각종 2-12의 경우는 미국에서 매년 100, 000 명 당으로 추정 하 고 MDS의 발병 률 증가 나이, 노화 미국 인구^{3, 주어진 이해 하는 중요 한 조건 만들기 5}. MDS의 대부분의 경우는 더 명확한 병 인, MDS의 경우 벤젠, 그리고 암 화학요법⁶같은 용 매를 포함 하 여 알려진된 차적인 에이전트에 노출 때문에 생각 된다.

MDS 환자 일반적으로 MDS 셀⁷에 돌연변이 인수 했습니다. 비록 상대적으로 드문, MDS 환자 수 유전자 NUP98, EVI1, RUNX1, MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) 등을 포함 하는 균형된 염색체 translocations를 인수 했습니다. 우리 연구소는 염색체 translocations, NUP98 유전자⁸을 포함에 대 한 오랜 관심 있습니다. 유전자 변형 마우스 NUP98-HOXD13 (NHD13) transgene Vav1 발기인에 의해 규제 및 증강 요소 표시의 모든 MDS, 주변 혈액 cytopenias, 발육 이상, 및 AML^{9 변환 형태 론 적 증거를 포함 하 여 주요 기능을 표현} .

MDS는 60 년¹⁰에 대 한 인정을 받고 있다 고 클론 줄기 세포 장애로 간주 됩니다, engraft 인적 MDS 셀 immunodeficient 마우스에 노력 하지 크게 성공 했습니다, MDS 셀 engraft 저조한^{11, 때문에 12,,1314} 및 쥐 임상 질병을 개발 하지 않습니다. 조 혈 모 세포는 MDS를 전송할 수 있습니다 식별 하는 노력에서 우리 NHD13 모델 그리고 모든 주변 혈액 cytopenias를 포함 하 여 인적 MDS의 기본적인 기능을 보여준 질병 엔터티로 MDS를 engraft 수 있는 우리가 나타났다 발육 이상, 그리고 AML¹⁵변환입니다. 이 보고서에서 우리는 MDS 시작 셀을 식별 하기 위해에서 이러한 실험, 뿐만 아니라 조 혈 줄기와 선구자 세포 (HSPC), 더 이상 충분치 접근의 기술적인 세부 사항 제시.

Protocol

이 문서에서 설명 하는 동물 절차 베 데스 다 동물 관리 및 사용 위원회, 국립 암 연구소에 의해 승인 했다 그리고 인간적 관심과 실험실 동물의 사용에는 공중 보건 서비스 정책에 포함 된 정책 준수는 동물 복지 행위, 그리고 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드. 1. 세포 준비 수확 골 nucleated 세포 (BMNC) 메 마른 재료만을 사용 합니다. 소독 증기 압력솥을 사?…

Representative Results

우리는 몇 가지 실험의 결과 대 한 대표적인 수치를 보여줍니다. 그림 1 실험 정렬 대표 cytometry를 보여준다. 정상적인 조 혈 차별화, 동안 세포가 특정 조 혈 혈통에 최선을 다하고 그들은 혈통 정의 세포 표면 마커를 확보 고 자기 갱신에 대 한 가능성을 잃게. 따라서, 야생-타입 마우스, 줄기 세포 자체-갱신은 혈통 부정적인 BMNC에 국한. 이 실험에서 ?…

Discussion

MDS는 클론 조 혈 줄기 세포 장애, MDS “줄기”, 또는 시작 셀 특징 되었습니다 아직 없습니다. 우리는 이전 MDS transplantable WT 쥐 HSCT, macrocytic 빈혈증, leukopenia, 호 중구 감소 증, 그리고 발육 이상¹⁵의 morphologic 증거 특징에 의해 NHD13 쥐에서 골 수를 사용 하 여 될 수 있는 시연 했다. 또한, 경쟁력 있는 repopulation 분석 NHD13 MDS 골 수에서 세포의 성장 우위를 확인. 함께 찍은, 이러한 결과 MDS…

Materials

14 mL round bottom tube	Falcon	352057
Hank's balanced salt solution	Lonza	10-527F
Anti-CD45.2 antibody	Southern Biotech	1800-15	LOT# A077-T044O
3 mL Syringe	Monoject	8881513934
27-G needle	BD	305109
20-G needle	BD	305176
Lineage Cocktail	Miltenyi	130-090-858	LOT# 5170418221
Anti-Biotin antibodies	Miltenyi	130-113-288	LOT# 5171109046
1 mL Syringe	Excelint	26027	Insulin Syringe
Heating Lamp	Thermo Fisher Scientific	E70001901
FACS machine	Cytec	FACScan	2 lasers, 5 color detectors
FACS sorting instrument	Beckman Coulter	MOFLO ASTRIOS	5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously
Propidium Iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566
Gamma Irradiator	Best Theratronics	Gammacell 40
Blood collection tube	RAM scientific	76011
Recipient mice	Charles River	B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 mice	n/a	C57Bl/6, CD45.2	Colony maintained at NIH
5 mL round bottom tube	Falcon	352058