Summary
Descriviamo l'uso del trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) per valutare il potenziale maligno delle cellule emopoietiche geneticamente. HSCT è utile per valutare varie cellule ematopoietiche maligne in vivo , nonché generando un'ampia coorte di topi con sindromi mielodisplastiche (MDS) o leucemia per valutare nuove terapie.
Abstract
Sindromi mielodisplastiche (SMD) sono un gruppo eterogeneo di disordini di cellule staminali ematopoietiche che sono definiti da ematopoiesi inefficace, sangue periferico citopenie, displasia e una propensione per la trasformazione in leucemia acuta. Topi transgenici NUP98-HOXD13 (NHD13) ricapitolano MDS umano in termini di sangue periferico citopenie, displasia e trasformazione in leucemia acuta. Precedentemente abbiamo dimostrato che MDS può essere trasferito da un topo geneticamente ingegnerizzato con MDS ai destinatari di selvaggio-tipo di trapianto di cellule di midollo osseo nucleata MDS (BMNC). Più chiaramente capire la cella MDS di origine, abbiamo sviluppato approcci di trapiantare specifici, immunophenotypically definito sottoinsiemi ematopoietici. In questo articolo, descriviamo il processo di isolamento e di trapianto di specifiche popolazioni di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici. A seguito di trapianto, descriviamo gli approcci per valutare l'efficacia del trapianto e la persistenza delle cellule MDS del donatore.
Introduction
Le sindromi mielodisplastiche (MDS) rappresentano un gruppo eterogeneo di disordini clonali sangue caratterizzati da ematopoiesi inefficace, prova morfologica della displasia e una propensione per la trasformazione in leucemia mieloide acuta (AML)1,2 ,3,4. Ematopoiesi inefficace è riconosciuto come un arresto di maturazione nel midollo osseo e risultati nel sangue periferico citopenie nonostante un1,di midollo osseo ipercellulare3. L'incidenza di MDS è stato variamente stimato di 2-12 casi ogni 100.000 persone ogni anno negli Stati Uniti, e l'incidenza di MDS aumenta con l'età, rendendo questo una condizione importante per capire dato l'invecchiamento US popolazione3, 5. Anche se la maggior parte dei casi di MDS non hanno nessuna eziologia libera, alcuni casi di MDS sono probabilmente dovuto l'esposizione agli agenti genotossici noti, inclusi i solventi come benzene e cancro chemioterapia6.
Pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno in genere acquisito mutazioni in cellule MDS7. Anche se relativamente raro, un numero di pazienti con sindromi mielodisplastiche hanno acquisito le traslocazioni cromosomiche bilanciate che coinvolgono geni quali NUP98, EVI1, RUNX1 e MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Il nostro laboratorio ha un interesse profondo traslocazioni cromosomiche, che coinvolgono il gene NUP988. Topi transgenici che esprimono un transgene NUP98-HOXD13 (NHD13) regolato dal promotore Vav1 e gli elementi enhancer di visualizzare tutte le caratteristiche chiave di MDS, compreso il sangue periferico citopenie, prova morfologica della displasia e la trasformazione di AML9 .
Sebbene MDS sono stati riconosciuti per oltre 60 anni10e sono considerati come un disordine clonale della cellula formativa, gli sforzi per attecchire cellula umana di MDS in topi immunodeficienti sono stati in gran parte infruttuosi, perché le cellule MDS integrano scarsamente11, 12,13,14 e i topi non sviluppano la malattia clinica. Nel tentativo di identificare quali cellule ematopoietiche possono trasmettere MDS, abbiamo girato per il modello di NHD13 e ha mostrato che noi potremmo interdigitate MDS come un'entità di malattia che ha mostrato tutti i segni cardinali di MDS umana, tra cui sangue periferico citopenie, displasia, e trasformazione da AML15. In questo rapporto, presentiamo i dettagli tecnici di questi esperimenti, nonché approcci ulteriormente frazionare ematopoietiche staminali e cellule del precursore (HSPC), nel tentativo di identificare cellule d'inizio di MDS.
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Protocol
Le procedure animale descritte in questo articolo sono state approvate dal National Cancer Institute a Bethesda Animal Care e Comitato di uso e sono conformi alle politiche contenute all'interno, la politica di servizio di sanità pubblica su cura umanitaria e uso di animali da laboratorio, il Animal Welfare Act e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. cella preparazione
- Raccolta del midollo osseo cellule nucleate (BMNC)
- Utilizzare solo materiali sterili. Sterilizzare gli strumenti riutilizzabili usando un autoclave a vapore. Acquisto di aghi, siringhe e oggetti in plastica in contenitori sterili monouso. Effettuare tutte le manipolazioni di cellulare e dell'animale in una classe II, tipo A2 sicurezza microbiologica.
- Preparare la BMNCs in un 14 mL contenente 3 mL di HF2 provetta a fondo sferico (Hank equilibrata soluzione salina completati con 2% di siero fetale bovino).
- Eutanasia C57Bl6 topi donatore (positivi per CD45 allele CD45.2), di età in genere 2-6 mesi, utilizzando una camera di CO2 .
- Sterilizzare la carcassa del mouse spruzzando etanolo al 70% su tutto il corpo con un flacone spray. La buccia dalle gambe, dal bacino fino alla caviglia.
- Rimuovere i femori e le tibie dalla carcassa utilizzando forbici sterili (dritto, punte acute, 11,5 cm) e forcipe (Graefe, seghettata, Larghezza punta 0,8 mm). Tagliare la relativa muscolatura chiaramente.
- Tagliare le estremità prossimale e distale della tibia con le forbici. Tenendo la tibia con il forcipe, inserire una siringa da 3 mL calibro 27 contenente 2,5 mL di HF2 nella cavità del midollo tibial all'estremità distale della tibia (caviglia). Lavare le cellule del midollo osseo dalla tibia con una leggera pressione in 14 mL provetta a fondo sferico.
- Ripetere per l'altra tibia.
- Tagliare le estremità prossimale e distale del femore con le forbici. Svuotamento della cavità del midollo di femore inserendo un ago di calibro 20 collegato ad una siringa da 3 mL contenente 2,5 mL di HF2 nell'estremità distale della cavità del midollo di femore e applicando la pressione delicata alla siringa.
- Ripetere per altre femore, raccogliendo tutti i del midollo osseo da entrambe le tibie e femori nella stessa 14 mL fondo tubo tondo.
- Disperdere la massa di midollo aspirando su e giù più volte con lo stesso calibro 20 ago collegato alla siringa da 3 mL.
- Macchiatura dell'anticorpo di BMNC
- Conteggio BMNC. Aggiungere 20 µ l di una soluzione di acido acetico 3% a 20 µ l della sospensione BMNC generata nel passaggio 1.1.8. Poi, di contare con un emocitometro e un microscopio invertito.
- A pellet il BMNC mediante centrifugazione delicata a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con HF2 utilizzando 90 µ l per 107 celle e aggiungere 10 µ l di anticorpo anti-lignaggio biotinilato cocktail alla sospensione di cellule.
- Dopo incubazione per 20 min a 4 ° C, lavare le cellule marcate con 3 mL di tampone fosfato salino (PBS).
- Risospendere il BMNC con 100 µ l di HF2 per 107 cellule. Aggiungere 2 µ l di allophycocyanin (APC) coniugato anti-biotina anticorpo per la sospensione di eritrociti, seguita da incubazione a 4 ° C per 20 min.
- Sciacquare il BMNC macchiato con 3 mL di PBS e risospendere il BMNC con HF2 completati con 0,2 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) per l'ordinamento delle cellule di flusso cytometry.
- Flusso cytometry ordinamento delle cellule di BMNC
- Calibrare il classificatore celle di flusso cytometry. Ottimizzare tutti i tubi di fotomoltiplicatore (PMT), scatter e parametri di fluorescenza usando le cellule non macchiate e impostare all'interno della gamma lineare di ogni rivelatore.
- Preparare non macchiate, PI-macchiato, e APC etichettato lignaggio cocktail celle in parallelo dal punto 1.2. Analizzare per compensazione spettrale.
- Discriminare le cellule doppietto di gating sequenziale di FSC-H vs SSC-H, 640-SSC-A vs 640-SSC-H e 640-SSC-S vs 640-SSC-W.
- Escludere le cellule non vitali utilizzando PI eccitato a 561 nm ed emissione raccolti con un filtro passa-banda 614/20. Eccitare il lignaggio APC etichettati cellule a 640 nm e raccogliere emissione con un filtro passa-banda 671/30.
- Registrare valori di fluorescenza come altezza di tensione e raccogliere almeno 100.000 eventi nei file di dati di modalità elenco per visualizzare le popolazioni di essere ordinati.
- Calcolare la compensazione spettrale dopo l'acquisizione di tre campioni di 10.000 cellule per i seguenti: senza etichetta celle, PI etichettati cellule e cocktail di anti-lignaggio anticorpo coniugato con etichettati cellule APC.
- Impostare tre regioni per ordinare lignaggio negativo (LN), lignaggio positiva (LP) con l'intensità di fluorescenza dim (LP1) e la popolazione di LP con fluorescenza brillante (LP2) in provette da 5 mL contenente 0,5 mL di media di 10% FBS.
- Celle di ordinamento utilizzando un'una goccia avvolgono e purificano la modalità di interruzione.
- Eseguire analisi di tipo post con 1.000 cellule totali su ogni campione ordinato per confermare la purezza e la vitalità delle cellule ordinate.
- Raccogliere le cellule ordinate mediante centrifugazione a 450 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare con 0,5 mL di HF2.
- Confermare ordinato cella numero con emocitometro e tripan blu. Regolare il numero di cellulare con HF2 per trapianto.
Nota: Un ampio spettro di popolazioni BMNC può essere isolato per trapianto utilizzando ulteriori combinazioni degli anticorpi coniugati fluorocromo passo 1.2.2 sopra.
2. destinatario topi preparazione e trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT)
- Preparazione dei destinatari del trapianto
- Mantenere la veterinaria e allevamento cura dei topi Congenici destinatario (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) in una struttura animale patogeni specifici (SPF) di libero.
- Per la decontaminazione profilattica della pista gastrointestinale, fornire acqua sterile contenente 100 mg/L di ciprofloxacina ai destinatari per 7 giorni prima dell'irradiazione della dose letale (9 Gy) e mantenere per 14 giorni dopo l'irradiazione.
- Fornire un'irradiazione di dose letale (9 Gy) da una fonte Cs come segue. Utilizzare un operatore addestrato, certificato di Cs. Impostare lo strumento di origine Cs a consegnare irradiazione gamma di 70 cGy/min totale del corpo. Posto 10 topi in un supporto personalizzati e inserire il supporto della camera di irradiatore. Consegnare l'irradiazione dal corpo intero di 9 Gy in 13 min e restituire i topi nelle loro gabbie.
- Trapianto di cellule staminali ematopoietiche
- Mescolare wild type (WT) BMNC da un mouse di destinatario Congenici (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) ad una dose di cella di 2 x 105 celle per mouse con 2-5 x 104 cellule del test purificato che BMNC preparato con flusso cytometry ordinamento come descritto in 1.3 di cui sopra. Mescolare le cellule nella stessa siringa.
Nota: Il BMNC WT forniscono un effetto con parsimonia di radiazione al destinatario mouse e consentono la sopravvivenza del mouse destinatario se le celle di prova non supportano l'ematopoiesi. Il WT BMNC utilizzato in questo tipo di esperimento espressa l'allele CD45.1 e così può essere distinto dalle cellule test usando gli anticorpi che discriminano tra CD45.1 e CD45.2. Le cellule WT BM si riferiscono a come "cellule helper", "cellule di radiazione-sparing" o "cellule concorrente". - Regolare il volume di miscela delle cellule a 200 µ l per destinatario utilizzando HF2 sterile per facilitare l'iniezione.
- Le miscele di cella per i topi irradiati letalmente di destinatario via endovenosa vena iniezione coda utilizzando una siringa da 1 mL e un ago 28 calibri, entro 24 h di irradiazione del trapianto. Posizionare la coda di topo sotto una lampada di calore, come calore conduce alla dilatazione della vena della coda.
Nota: Tutti i topi destinatari alla fine dello studio di eutanasia e valutare la progressione di malattia di autopsia, l'istologia e citometria a flusso.
- Mescolare wild type (WT) BMNC da un mouse di destinatario Congenici (B6-LY5.1/Cr, CD45.1) ad una dose di cella di 2 x 105 celle per mouse con 2-5 x 104 cellule del test purificato che BMNC preparato con flusso cytometry ordinamento come descritto in 1.3 di cui sopra. Mescolare le cellule nella stessa siringa.
3. engraftment analisi mediante citometria a flusso
- Per valutare engraftment delle cellule dei donatori, raccogliere sangue periferico (PB) dai topi destinatari alla 6a settimana, settimana 12 e 16 ° settimana dopo il trapianto.
- Scaldare i destinatari nella gabbia con lampada di calore per circa 1 min e posizionare il mouse in un dispositivo di ritenuta.
- Tagliare la vena della coda con un bisturi (lama 10, manico per bisturi #3) e raccogliere 100 µ l di PB per ogni destinatario utilizzando un tubo di microcapillary contenenti EDTA come anticoagulante.
- Dividere il PB raccolto in due aliquote uguali inserendo 50 µ l in una microcentrifuga sterile. Utilizzare un'aliquota per un conteggio di anima completa (CBC) automatizzato (eseguita presso il Core di istopatologia NCI) e utilizzare la seconda aliquota per la macchiatura dell'anticorpo e citometria a flusso.
- Per rilevare il engraftment erogatore da citometria a flusso, lisare i globuli rossi (RBC) aggiungendo 1 mL di tampone di Lisi ipotonica RBC (8,29 g/L di NH4Cl, 1 g/L di KHCO3, 0,037 g/L di Na2EDTA, pH 7,2) a 50 µ l del PB raccolti. Vortexare il campione di miscelare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare il lisato PB a 4.600 x g per 1,5 min attentamente aspirare il supernatante e scartare.
- Parzialmente di disturbare il pellet cellulare delicatamente toccando o "sfogliando" il fondo della provetta. Aggiungere 1,3 mL di PBS nel pellet si trova in provetta e centrifugare a 4.600 x g per un minimo di 1,5 accuratamente aspirato e scartare il surnatante.
- Disturbare il pellet cellulare toccando o sfogliando e aggiungere 200 µ l di HF2 completati con 5% di siero del ratto per il pellet cellulare.
- Aggiungere anticorpo anti-CD45.2 (1 µ l) coniugato con allophycocyanin (APC) per la sospensione delle cellule. Incubare a 4 ° C per almeno 30 min e brevemente vortice la miscela.
- Dopo la colorazione, lavare le cellule due volte come sopra descritto e risospendere con 400 µ l di HF2 completati con 1 µ g/mL di PI.
- Rilevare l'attecchimento utilizzando un citometro a flusso di 4 colori. Ottenere ulteriori informazioni sui tipi di cellulari all'interno del sangue periferico mediante l'aggiunta di altri anticorpi per rilevare tipi cellulari specifici, quali linfociti B o T.
- Registrare dati di attecchimento seriale utilizzando un foglio di calcolo per consentire un'ulteriore analisi dei dati.
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Representative Results
Vi mostriamo le figure rappresentative per risultati di molti esperimenti. La figura 1 Mostra un rappresentante flusso cytometry ordinamento esperimento. Durante il differenziamento ematopoietico normale, come le cellule diventano impegna un specifico lineage ematopoietico, acquisiscono lignaggio-definizione di indicatori di superficie delle cellule e perdere il potenziale di auto-rinnovamento. Pertanto, in topi wild-type, autorinnovamento delle cellule staminali è confinata a BMNC lignaggio-negativo. In questo esperimento, abbiamo risolto BMNC dal midollo osseo NHD13 in cellule di lignaggio-positive positivo e alto lignaggio-negativo, basso lignaggio. Questi ordinati cellule poi sono state trapiantate nei destinatari WT per determinare la capacità di auto-rinnovamento.
La figura 2 Mostra i risultati di un esperimento separato, in cui lignaggio cellule negative o indifferenziate cellule da donatori di NHD13 con MDS sono state trapiantate in irradiati letalmente destinatari WT. Le cellule del donatore di NHD13 espresso il marcatore di superficie delle cellule CD45.2, mentre le cellule di concorrente WT (cfr. sezione 2.2.1 sopra) espresso il marcatore di superficie delle cellule CD45.1. La figura 3 Mostra l'analisi di engraftment seriale indifferenziati NHD13 BMNC o lignaggio-negativo NHD13 BMNC. Dopo circa 16 settimane, le cellule NHD13 prevalere le cellule WT, come dimostra la crescente percentuale di cellule CD45.2 + nel sangue periferico. Figura 4 Mostra un esempio di trasformazione leucemica da un mouse trapiantato con cellule NHD13 MDS.
Figura 1: flusso cytometry ordinamento strategia di BMNC macchiato con l'anticorpo di lignaggio cocktail. Ogni scatola rettangolare sulla trama del puntino rappresenta la popolazione delle cellule ordinata per il trapianto valutare la funzione delle cellule. R4, lignaggio negativo; R5, basso lignaggio positivo; R6, positivo di alto lignaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: profili di FACS rappresentativi per l'analisi di engraftment usando donatore specifico anticorpo anti-CD45.2. Destinatario BMNC è stato trapiantato con 1 X 106 NHD13 BMNC (CD45.2 +) e cellule del destinatario LNBM con 5 X 104 NHD13 lignaggio negativo BM (CD45.2 +). In ogni caso, 2 x 105 WT BMNC (CD45.1 +) sono stati utilizzati come celle di concorrente. Numeri per il positivo CD45.2 rappresentano caselle superiore e inferiore (derivato da NHD13 donatore) e CD45.2 negativo (derivato da cellule WT concorrente), rispettivamente, in post-trapianto 6 settimane e 24 settimane. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cinetica di Engraftment di singoli destinatari dopo trapianto. Ogni linea nel grafico viene illustrato saggi di attecchimento seriale di un mouse a singolo destinatario. I destinatari BMNC sono stati trapiantati con 1 X 106 cellule di NHD13 tutta BMNC e destinatari LNBM sono stati trapiantati con 5 X 104 di NHD13 lignaggio BM negativo dopo l'ordinamento. NHD indica NHD13 donatore. BM, BMNC destinatari topi; LNBM, destinatario di BM negativo lignaggio; PBMC, cellule mononucleate di sangue periferico. In tutti i casi, le cellule del donatore NHD13 gradualmente prevalere le cellule WT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: colorazione di May-Grünwald Giemsa (MGG) del midollo osseo (BM) dal destinatario MDS che ha progredetto per AML. Si noti la presenza di numerose esplosioni e forme immature. Le frecce indicano gli scoppi e punte di freccia indicano forme immature. Originale 400 X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se MDS sono un disordine clonale di cellule staminali ematopoietiche, il MDS "gambo", o cellule di origine, non sono ancora state caratterizzate. Precedentemente abbiamo dimostrato che MDS possono essere transplantable ai topi WT usando il midollo osseo dai topi NHD13 di HSCT, caratterizzata da anemia macrocitica, leucopenia, neutropenia e prova morfologica della displasia15. Inoltre, analisi competitiva ripopolamento identificato un vantaggio di crescita delle cellule dal midollo osseo NHD13 MDS. Presi insieme, questi risultati implicano l'esistenza di un gambo MDS o cella d'inizio. Ulteriori esperimenti sono ora in corso, mirato a perfezionare la immunophenotypic caratteristiche di un inizio di MDS cellula15 usando più definiti staminali e progenitrici delle cellule gli indicatori (CD150, CD48, c-Kit e Sca-1)16 combinato con il lignaggio marcatore che macchia il metodo descritto in questo protocollo.
Identificazione MDS avvio cellule usando topi NHD13 coinvolge vasto flusso cytometry ordinamento procedura. La manipolazione ex vivo di primaria BMNCs luoghi di stress sulle cellule, potenzialmente con conseguente morte delle cellule o perdita funzionale. Pertanto, si dovrebbe compiere uno sforzo per ridurre il tempo di manipolazione ex vivo compreso il tempo di flusso cytometry ordinamento. Il bollitore e il modello di flusso cytometry strumenti e dinamica dei flussi sono altre variabili che possono influenzare la vitalità cellulare dopo l'ordinamento. La procedura HSCT richiede infusione delle cellule attraverso un vaso sanguigno. Anche se l'iniezione della vena della coda può essere una tecnica più impegnativa rispetto ad iniezione retro-orbitale, nella nostra esperienza, iniezione della vena della coda possa essere eseguite più rapidamente di iniezione retro-orbitale come i topi destinatari non sono anestetizzati per vena caudale iniezioni. Limitazione del volume di iniezione (per un massimo di 150 µ l) è un altro problema nel retro-orbitale iniezione17, come una maggiore concentrazione di cellule può portare a ulteriore perdita di cellule nel corso della preparazione delle cellule, come la tosatura delle cellule sulla parete delle siringhe e aghi.
Anche se questi esperimenti sono focalizzati sul modello NHD13 per MDS, gli approcci di ordinamento e trapianto HSCT qui descritti possono essere utilizzati per qualsiasi mouse geneticamente. Oltre a determinare le caratteristiche delle cellule ematopoietiche autorinnovabile, questo approccio di trapianto può essere utilizzato per altri scopi. Per esempio, se si vuole ottenere un'ampia coorte di topi con midollo osseo MDS per valutare l'efficacia del trattamento con una piccola molecola, un grande gruppo (30 + topi) possa essere generato da trapiantare topi WT con MDS considerando in alternativa, la strategia HSCT può essere invertita. Nel tentativo di curare i topi di MDS, NHD13 topi con MDS possono essere trapiantati con WT BM, e il successo del trapianto può essere monitorato valutando la proporzione di cellule ematopoietiche che esprimono CD45.1 (che segna WT BM) al contrario di CD45.2 (che segna MDS BM) 18.
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Disclosures
Non abbiamo nulla di divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, National Institutes of Health (concedere numeri ZIA SC 010378 e BC 010983).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
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