Användning av hematopoetisk stamcellstransplantation att bedöma beskärningen av myelodysplastiskt syndrom
Summary
Vi beskriver användningen av hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) att bedöma den maligna potentialen för genetiskt modifierade hematopoetiska celler. HSCT är användbart för utvärdering av olika elakartade hematopoetiska celler i vivo samt generera en stor kohort av möss med myelodysplastiska syndrom (MDS) eller leukemi för att utvärdera nya terapier.
Abstract
Myelodysplastiskt syndrom (MDS) är en mångskiftande grupp av hematopoetiska stamceller störningar som definieras av ineffektiva blodbildning, perifera cytopenier, dysplasi och en benägenhet för transformation till akut leukemi. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgena möss recapitulate mänskliga MDS när det gäller perifera cytopenier, dysplasi och transformation till akut leukemi. Vi har tidigare visat att MDS kunde överföras från ett genetiskt modifierade mus med MDS till vildtyp mottagare av omplantering MDS nucleated benmärgsceller (BMNC). Till mer tydligt förstå MDS cellen ursprungsland, vi har utvecklat metoder att transplantera specifika, immunophenotypically definieras hematopoetiska delmängder. I den här artikeln beskriver vi processen med att isolera och omplantering specifika populationer av hematopoetiska stamceller och stamceller. Efter transplantation beskriver vi metoder för att bedöma effektiviteten av transplantation och uthållighet hos donatorcellerna MDS.
Introduction
Myelodysplastiskt syndrom (MDS) representerar en rad olika klonal blodsjukdomar som kännetecknas av ineffektiva blodbildning, morfologiska bevis av dysplasi och en benägenhet för transformation till akut myeloisk leukemi (AML)1,2 ,3,4. Ineffektiva blodbildning är erkänd som en mognad arresteringsorder i benmärgen, och leder till perifera cytopenier trots en hypercellular benmärg1,3. Incidensen av MDS har uppskattats omväxlande som 2-12 fall per 100 000 personer årligen i Sverige, och incidensen av MDS ökar med åldern, vilket gör detta till en viktig förutsättning att förstå med tanke på åldrandet U.S. befolkningen3, 5. Även om de flesta fall av MDS har ingen tydlig etiologi, tros vissa fall av MDS bero på exponering för kända genotoxiskt medel, inklusive lösningsmedel som bensen och cancer kemoterapi6.
MDS-patienter har normalt förvärvade mutationer i MDS cellerna7. Även om det är relativt ovanligt, har ett antal MDS patienter förvärvade balanserad kromosomala flyttningar som involverar gener som NUP98, EVI1, RUNX1 och MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). Vårt laboratorium har ett långvarigt intresse för kromosom flyttningar, som inbegriper den NUP98-gen8. Transgena möss som express en NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenens reglerad av promotorn Vav1 och enhancer element Visa alla de viktigaste funktionerna i MDS, inklusive perifera cytopenier, morfologiska bevis av dysplasia, och omvandling till AML9 .
Även om MDS har erkänts för över 60 år10, och anses vara en klonal stamceller störning, har ansträngningar att engraft mänsklig MDS cell i nedsatt immunförsvar möss varit till stor del misslyckade, eftersom MDS cellerna engraft dåligt11, 12,13,14 och mössen inte utvecklar klinisk sjukdom. I ett försök att identifiera vilka hematopoetiska celler kan överföra MDS, vi vände sig till den NHD13 modellen, och visade att vi kunde engraft MDS som en sjukdom-enhet som visade alla kardinal funktioner av mänskliga MDS, inklusive perifera cytopenier, dysplasi, och omvandling till AML15. I denna rapport presenterar vi de tekniska detaljerna i dessa experiment, samt strategier för ytterligare fractionate hematopoetiska stamceller och föregångare celler (HSPC), i ett försök att identifiera MDS-inleda celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om MDS är en klonal hematopoetiska stamceller störning, MDS ”stam” eller initierande celler, har ännu inte karaktäriserats. Vi har tidigare visat att MDS kan vara transplanterbara WT möss med benmärg från NHD13 möss av HSCT, kännetecknas av makrocytär anemi, leukopeni, neutropeni och morfologiska bevis av dysplasi15. Dessutom identifieras konkurrenskraftiga återinsättning analyser en tillväxt fördel av celler från benmärgen NHD13 MDS. Sammantaget antyda dessa fynd föreko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av intramurala forskningsprogrammet av National Cancer Institute, National Institutes of Health (bevilja nummer ZIA SC 010378 och BC 010983).
Materials
| 14 mL round bottom tube | Falcon | 352057 | |
| Hank's balanced salt solution | Lonza | 10-527F | |
| Anti-CD45.2 antibody | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL Syringe | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G needle | BD | 305109 | |
| 20-G needle | BD | 305176 | |
| Lineage Cocktail | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| Anti-Biotin antibodies | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL Syringe | Excelint | 26027 | Insulin Syringe |
| Heating Lamp | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS machine | Cytec | FACScan | 2 lasers, 5 color detectors |
| FACS sorting instrument | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 lasers, 23 parameters, 6 population sorting simulteneously |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Gamma Irradiator | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| Blood collection tube | RAM scientific | 76011 | |
| Recipient mice | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 mice | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | Colony maintained at NIH |
| 5 mL round bottom tube | Falcon | 352058 |
References
- Corey, S. J., et al. Myelodysplastic syndromes: the complexity of stem-cell diseases. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 118-129 (2007).
- Garcia-Manero, G. Myelodysplastic syndromes: 2015 Update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 90 (9), 831-841 (2015).
- Heaney, M. L., Golde, D. W. Myelodysplasia. The New England Journal of Medicine. 340 (21), 1649-1660 (1999).
- Nimer, S. D. Myelodysplastic syndromes. Blood. 111 (10), 4841-4851 (2008).
- Aul, C., Giagounidis, A., Germing, U. Epidemiological features of myelodysplastic syndromes: results from regional cancer surveys and hospital-based statistics. International Journal of Hematology. 73 (4), 405-410 (2001).
- Pedersen-Bjergaard, J., Christiansen, D. H., Desta, F., Andersen, M. K. Alternative genetic pathways and cooperating genetic abnormalities in the pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Leukemia. 20 (11), 1943-1949 (2006).
- Uy, G. L., et al. Dynamic changes in the clonal structure of MDS and AML in response to epigenetic therapy. Leukemia. 31 (4), 872-881 (2017).
- Gough, S. M., Slape, C. I., Aplan, P. D. NUP98 gene fusions and hematopoietic malignancies: common themes and new biologic insights. Blood. 118 (24), 6247-6257 (2011).
- Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. NUP98-HOXD13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia. Blood. 106 (1), 287-295 (2005).
- Block, M., Jacobson, L. O., Bethard, W. F. Preleukemic acute human leukemia. Journal of the American Medical Association. 152 (11), 1018-1028 (1953).
- Thanopoulou, E., et al. Engraftment of NOD/SCID-beta2 microglobulin null mice with multilineage neoplastic cells from patients with myelodysplastic syndrome. Blood. 103 (11), 4285-4293 (2004).
- Kerbauy, D. M., Lesnikov, V., Torok-Storb, B., Bryant, E., Deeg, H. J. Engraftment of distinct clonal MDS-derived hematopoietic precursors in NOD/SCID-beta2-microglobulin-deficient mice after intramedullary transplantation of hematopoietic and stromal cells. Blood. 104 (7), 2202-2203 (2004).
- Benito, A. I., et al. NOD/SCID mice transplanted with marrow from patients with myelodysplastic syndrome (MDS) show long-term propagation of normal but not clonal human precursors. Leukemia Research. 27 (5), 425-436 (2003).
- Medyouf, H., et al. Myelodysplastic cells in patients reprogram mesenchymal stromal cells to establish a transplantable stem cell niche disease unit. Cell Stem Cell. 14 (6), 824-837 (2014).
- Chung, Y. J., Choi, C. W., Slape, C., Fry, T., Aplan, P. D. Transplantation of a myelodysplastic syndrome by a long-term repopulating hematopoietic cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14088-14093 (2008).
- Pietras, E. M., et al. Functionally Distinct Subsets of Lineage-Biased Multipotent Progenitors Control Blood Production in Normal and Regenerative Conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Chung, Y. J., Fry, T. J., Aplan, P. D. Myeloablative hematopoietic stem cell transplantation improves survival but is not curative in a pre-clinical model of myelodysplastic syndrome. PLoS One. 12 (9), e0185219 (2017).
