Metoder for å vurdere rollen c-Fos og Dusp1 i Oncogene avhengighet
Summary
Her beskriver vi protokoller for genetiske og kjemiske valideringen av c-Fos og Dusp1 som narkotika mål i leukemi bruker i vitro og in vivo genetiske og humanized musen modeller. Denne metoden kan brukes på noen mål for genetisk validering og terapeutiske utvikling.
Abstract
Demonstrasjon av tyrosine kinase hemmere (TKIs) i behandling av Kronisk myelogen leukemi (bruk) har innledet en ny æra i cancer therapeutics. Men svarer en liten populasjon av celler ikke TKI behandling, noe som resulterer i minimal gjenværende sykdom (MRD); selv de mest potente TKIs ikke utrydde disse cellene. Disse MRD celler tjene som et reservoar å utvikle resistens til terapi. Hvorfor TKI behandling er ineffektive mot MRD celler er ikke kjent. Vekstfaktor signalnettverk er involvert i å støtte overlevelsen MRD celler under TKI behandling, men en mekanistisk forståelse mangler. Nyere studier har vist at et forhøyet c-Fos og Dusp1 uttrykk som følge av konvergent kreftfremkallende og vekstfaktor signalering i MRD celler megle TKI motstand. Genetiske og kjemiske hemming av c-Fos og Dusp1 gjengir bruk utsøkt sensitive til TKIs og herdes bruk i både genetiske og humanized musen modeller. Vi identifisert disse mål genene bruker flere microarrays fra TKI-sensitive og -resistente celler. Her gir vi metoder for målet validering bruker i vitro og in vivo musen modeller. Disse metodene kan lett brukes på noen mål for genetisk validering og terapeutiske utvikling.
Introduction
Konstituerende tyrosin kinase aktivitet av BCR-ABL1 fusion oncogene forårsaker bruk, som gir en begrunnelse for å målrette kinase aktiviteten av lite molekyl inhibitors. Suksessen til TKIs i behandling av bruk pasienter revolusjonerte begrepet målrettet terapi1,2. Deretter anti-kinase terapi som presisjon medisin ble utviklet for flere andre malignitet, inkludert solide svulster. Hittil er mer enn tretti kinase hemmere godkjent av United State FDA for å behandle ulike malignancies. Mens TKI behandling er svært effektiv i undertrykke sykdommen, er det ikke helbredende. Dessuten, en liten populasjon av kreftceller vedvarer under behandlingen: MRD3,4,5. Selv pasienter som viste fullstendig remisjon igjen med MRD, som til slutt resultater i tilbakefall hvis ikke kontinuerlig undertrykt. Derfor er utrydding av MRD celler nødvendig for å oppnå et holdbart eller helbredende svar. Bruk representerer en verdifull paradigmet for å definere begrepet presisjon medisin, mekanismer for oncogenesis, rasjonell mål-rettet therapeutics, sykdomsprogresjon og resistens. Men selv i dag, mekanismen kjøring TKI-indusert celledød i kreftceller er ikke fullt ut forstått, eller hvorfor MRD celler (består av leukemic stamceller [LSCs]) er egentlig motstandsdyktig mot TKIs4,6. Likevel er fenomenet “oncogene avhengighet” mutant kinase oncoprotein involvert i TKI effekt der akutt hemming av målrettede oncogene ved TKIs forårsaker en kreftfremkallende støt som fører til en massiv proapoptotic svaret eller gågaten i cellen kontekst-avhengige måte6,7,8,9. Imidlertid mangler den mekanistiske understøttelsen av oncogene avhengighet. Nyere studier har innblandet som vekstfaktor signalisering opphever oncogene avhengighet og følgelig gir motstand mot TKI terapi10,11,12. Derfor, for å få innsikt i mekanismen av oncogene avhengighet, vi spilte hele-genome expression profilering BCR-ABL1 avhengige og nonaddicted celler (vokst med vekstfaktorer), som viste at c-Fos og Dusp1 er kritiske meglere på oncogene avhengighet13. Genetisk sletting av c-Fos og Dusp1 er syntetiske dødelig for BCR-ABL1-uttrykke celler musene som brukes i eksperimentet utvikle ikke leukemi. Videre kurert hemming av c-Fos og DUSP1 av små molekyl hemmere BCR-ABL1-indusert bruk i mus. Resultatene viser at uttrykket nivåene av c-Fos og Dusp1 definerer apoptotisk terskelen i kreftceller, slik at lavere nivåer konferere narkotika følsomhet mens høyere nivåer føre til terapi13.
For å identifisere genene kjøring oncogene avhengighet, utført vi flere hele-genome expression profilering eksperimenter i nærvær av vekstfaktor og en TKI (imatinib) med både mus- og bruk pasient-avledet celler (K562). Disse dataene ble analysert parallelt med bruk pasienten datasett fra CD34+ blodkreft stamceller før og etter behandling med imatinib. Analysen avdekket tre gener (en transkripsjon faktor [c-Fos], dobbelt spesifisitet fosfatase 1 [Dusp1], og en RNA-bindende protein [Zfp36]) som er ofte upregulated i TKI-resistente celler. For å validere betydningen av disse genene i overdragelse resistens, gjennomført vi trinnvise i vitro og vivo analyse. Uttrykket nivåene av disse genene ble bekreftet av sanntids qPCR (RT-qPCR) og vestlige blotting i narkotika-resistente celler. Videre, cDNA overuttrykte og knockdown av shRNA hårnåler av c-Fos, Dusp1, og Zfp36 viste at opphøyet c-Fos og Dusp1 uttrykk er tilstrekkelig og nødvendig å tildele TKI motstand. Derfor utført vi en i vivo validering bruker musen modeller med c-Fos og Dusp1 bare. For genetisk valideringen av c-Fos og Dusp1, vi opprettet ROSACreERT-induserbart c-Fosfl/fl mus (betinget knockout)14 og krysset dem med Dusp1– / – (rett knockout)15 å ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – dobbel-transgene mus. Ben margtransplantasjon-avledet c-Kit+ celler (fra c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –– og c-Fosfl/flDusp1– / –) uttrykker BCR-ABL1 var analysert i vitro colony-forming unit (CFU) analysen, og i vivo av benmarg transplantasjon i drepende bestrålt mus, teste kravet til c-Fos og Dusp1 alene eller sammen i leukemi utvikling. Likeledes, de kjemiske hemninger c-Fos av DFC (difluorinated curcumin)16 og Dusp1 av BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 ble testet i vitro og in vivo bruker BCR-ABL1-uttrykke, bein margtransplantasjon-avledet c-Kit+ celler fra vill-type (WT) musen. For å bekrefte kravet til c-Fos og Dusp1 i leukemic stamceller, utnyttet vi en bruk musemodell der BCR-ABL1 var spesielt indusert i stilk celler av doxycycline (Tet-transactivator uttrykker under murine stamcelleforskningen leukemi (SCL) gen 3 enhancer regulering)18,19. Vi brukte benmarg Lin–Sca+c-Kit+ (LSK) celler fra disse musene i i vivo transplantasjon analysen. Videre etablerte vi phopsho-p38 nivåer og uttrykket IL-6 som pharmaco-dynamisk biomarkers for Dusp1 og c-Fos hemming, henholdsvis i vivo. Til slutt for å forlenge studiet for menneskelig relevans, pasient-avledede CD34+ celler (tilsvarer c-Kit+ cellene fra mus) ble utsatt til langsiktig in vitro kultur-starte cellen analyser (LTCIC) og en i vivo humanized musemodell Bruk20,21. Immunodeficient mus ble transplantert med bruk CD34 + celler, etterfulgt av behandling og human leukemic celle survival analyse.
I dette prosjektet utvikle vi metoder for mål identifisering og valideringer bruker både genetiske og kjemiske verktøy, bruker forskjellige prekliniske modeller. Disse metodene kan brukes for å validere andre mål utvikler kjemiske modaliteter for terapeutisk utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
For hoveddelen av kreftceller, er terapeutiske svaret TKI formidlet av en blokade av tyrosin kinase oncoprotein signaler som svulsten er avhengige av. Men er relativt lite kjent om hvordan et mindretall av kreftceller bidrar til MRD unnslippe oncogene avhengighet og terapi4. Studier viste at vekstfaktor signalering formidler resistens både leukemi og solid orgel svulster. Dette tyder på at ulike molekylære mekanismer kan grunn indre motstand10,<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er takknemlig til G. Q. Daley for å gi BaF3 og WEHI cellene T. Reya for den MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruksjoner. Forfatterne er takknemlige til M. Carroll for å gi pasientprøvene fra bruk blast krisen. Denne studien ble støttet av tilskudd til M.A. fra NCI (1RO1CA155091), leukemi Research Foundation og V Foundation, og NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
