Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene
Summary
Aqui, descrevemos os protocolos de validação genética e química de c-Fos e Dusp1 como um destino de droga em leucemia utilizando modelos in vitro e in vivo do mouse genética e humanizado. Esse método pode ser aplicado para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.
Abstract
A demonstração de inibidores de tirosina quinase (TKIs) no tratamento da leucemia mieloide crônica (LMC) tem anunciava uma nova era na terapêutica do câncer. No entanto, uma pequena população de células não responde ao tratamento de TKI, resultando em doença residual mínima (MRD); mesmo o mais potente TKIs falha para erradicar estas células. Estas células MRD servem como um reservatório de desenvolver resistência à terapia. Não é conhecido por tratamento de TKI é ineficaz contra células MRD. Fator de crescimento de sinalização está implicado no apoio a sobrevivência das células MRD durante o tratamento de TKI, mas está faltando uma compreensão mecanicista. Estudos recentes demonstraram que uma elevada c-Fos e Dusp1 expressão como resultado convergente oncogênicos e fator de crescimento de sinalização em células MRD mediam resistência TKI. A inibição genética e química de c-Fos e Dusp1 processa CML requintadamente sensível para TKIs e cura LMC em ambos os modelos genéticos e humanizado do mouse. Nós identificamos estes genes alvo usando microarrays múltiplas de células resistentes e – TKI-sensíveis. Aqui, nós fornecemos métodos de validação de destino utilizando modelos in vitro e in vivo de rato. Esses métodos podem ser facilmente aplicados para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.
Introduction
Atividade da quinase de tirosina constitutiva do oncogene de fusão BCR-ABL1 faz com que a CML, que fornece uma base racional para direcionar a atividade da quinase por inibidores de pequenas moléculas. O sucesso de TKIs no tratamento de pacientes com LMC revolucionou o conceito de terapia-alvo1,2. Posteriormente, a terapia antiquinase como medicina de precisão foi desenvolvida para várias outras malignidades, incluindo tumores sólidos. Até agora, mais de trinta inibidores da quinase foram aprovados pelo FDA Estado Unidos para o tratamento de várias neoplasias malignas. TKI tratamento é muito eficaz em suprimir a doença, não é curativa. Além disso, uma pequena população de células cancerosas persiste durante o tratamento: o MRD3,4,5. Mesmo os pacientes que mostrou remissão completa são deixados com MRD, que eventualmente resultados em recaída, se não continuamente reprimidos. Portanto, a erradicação de células MRD é necessário conseguir uma resposta curativa ou durável. LMC representa um paradigma valioso para definir o conceito de medicina de precisão, mecanismos de mixomas, terapêutica racional alvo-dirigido, progressão da doença e resistência às drogas. No entanto, até hoje, o mecanismo de morte celular induzida por TKI de condução em células de câncer não é totalmente compreendido, nem por células MRD (compostas por células leucêmicas [LSCs]) são intrinsecamente resistentes a TKIs4,6. Não obstante, o fenômeno de “dependência do oncogene” a oncoproteína quinase mutante está implicado na eficácia TKI onde a inibição aguda do oncogene orientada por TKIs provoca um choque oncogênicos que leva a uma resposta maciça proapoptotic ou quiescência na célula contexto-dependente6,7,8,9. No entanto, a base mecanicista da dependência do oncogene é carente. Estudos recentes têm implicados que fator de crescimento de sinalização revoga a dependência do oncogene e, consequentemente, confere resistência à terapia TKI10,11,12. Portanto, para obter conhecimento sobre o mecanismo da dependência do oncogene, realizamos a expressão do inteiro-genoma perfilação de BCR-ABL1 viciado e células nonaddicted (crescidas com fatores de crescimento), que revelaram que o c-Fos e Dusp1 são importantes mediadores da oncogene vício13. A exclusão genética de c-Fos e Dusp1 é letal para BCR-ABL1-expressando células e os ratos usados no experimento não desenvolveu leucemia. Além disso, a inibição de c-Fos e DUSP1 por inibidores de molécula pequena curado CML BCR ABL1-induzida em camundongos. Os resultados mostram que os níveis de expressão de c-Fos e Dusp1 definem o limiar de apoptose em células cancerosas, tal que os níveis mais baixos conferem sensibilidade de drogas enquanto que níveis mais elevados de causar resistência à terapia13.
Para identificar os genes dirigindo a dependência do oncogene, realizamos vários do inteiro-genoma expressão experimentos na presença de fator de crescimento e um TKI (imatinib) usando o mouse – e células de paciente-derivado de CML (K562) de criação de perfil. Estes dados foram analisados em paralelo com a CML pacientes conjuntos de dados obtidos de CD34+ células-tronco hematopoiéticas antes e após o tratamento com imatinib. Esta análise revelou três genes (um fator de transcrição [c-Fos], fosfatase dupla especificidade 1 [Dusp1] e uma RNA-proteína obrigatória [Zfp36]) que são comumente upregulated em células TKI-resistente. Para validar a importância destes genes em conferir resistência às drogas, realizamos análise in vitro e in vivo passo a passo. Os níveis de expressão destes genes foram confirmados por qPCR em tempo real (RT-qPCR) e mancha ocidental em células resistentes. Além disso, a superexpressão do cDNA e nocaute por grampos de shRNA de c-Fos, Dusp1, e Zfp36 revelou que elevado de c-Fos e Dusp1 expressões são suficientes e necessárias para conferir resistência TKI. Portanto, realizamos uma validação in vivo usando modelos do rato com o c-Fos e Dusp1 só. Para a validação genética de c-Fos e Dusp1, criamos ROSACreERT-inducible do c-Fosfl/fl ratos (nocaute condicional)14 e cruzou-os com Dusp1– / – (nocaute)15 tornar ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – ratos transgénicos-duplo. Células de medula óssea-derivado de c-Kit+ (de c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –– e c-Fosfl/flDusp1– / –) expressam BCR-ABL1 foram analisados em vitro em um ensaio de unidade (CFU) formadoras e em vivo por transplante de medula óssea em camundongos letalmente irradiados, para testar a exigência de c-Fos e Dusp1 sozinho ou em conjunto no desenvolvimento de leucemia. Do mesmo modo, as inibições químicas de c-Fos pela DFC (difluorinated curcumina)16 e Dusp1 pela BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 foram testados in vitro e in vivo usando BCR-ABL1-expressando, osso células da medula-derivado de c-Kit+ do mouse tipo selvagem (WT). Para confirmar a exigência de c-Fos e Dusp1 em células leucêmicas, utilizamos um modelo de mouse CML onde BCR-ABL1 foi especificamente induzida em suas células-tronco por doxiciclina (expressa Tet-liberada em células-tronco murino leucemia (SCL) gene 3′ potenciador Regulamento)18,19. Usamos a medula óssea Lin–c-Kit de Sca++ (LSK) células destes ratos em um ensaio in vivo de transplante. Além disso, estabelecemos níveis phopsho-p38 e a expressão de IL-6 como biomarcadores farmacodinâmicos para Dusp1 e inibição de c-Fos, respectivamente, na vivo. Finalmente, para estender o estudo para a relevância humana, derivado de paciente CD34+ as células (equivalente às células c-Kit+ de ratos) foram submetidas a longo prazo ensaios in vitro cultura-iniciando célula (LTCIC) e um modelo do rato humanizado em vivo CML20,21. Os camundongos imunodeficientes foram transplantados com células CML CD34 +, seguidas de tratamento medicamentoso e análise de sobrevivência de células leucêmicas humanas.
Neste projecto, desenvolvemos métodos para a identificação do alvo e validações usando ferramentas de genéticas e químicas, usando diferentes modelos pré-clínicos. Estes métodos podem ser aplicados com sucesso para validar outros alvos, desenvolvendo modalidades químicas para o desenvolvimento de terapêutica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para a maior parte das células cancerosas, a resposta terapêutica para TKI é mediada por um bloqueio de tirosina-quinase-oncoproteína sinais de que o tumor é viciado. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre como uma minoria das células cancerosas, contribuindo para MRD escape o oncogene dependência e terapia4. Estudos recentes revelaram que a sinalização de fator de crescimento Medeia resistência a drogas em leucemia e tumores de órgãos sólidos. Isto sugere que vários meca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos a G. Q. Daley para fornecer as células BaF3 e WEHI e T. Reya para o MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP constrói. Os autores agradecem ao M. Carroll pelo fornecimento das amostras de blástica da LMC. Este estudo foi suportado por subsídios para M.A. da Fundação V, leucemia Research Foundation e a ICN (1RO1CA155091) e do NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
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- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
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