Metoder för att utvärdera rollen av c-Fos och Dusp1 i onkogen beroende
Summary
Här beskriver vi protokoll för genetiska och kemiska validering av c-Fos och Dusp1 som drog mål i leukemi med hjälp av in vitro- och in vivo genetiska och humaniserad musmodeller. Denna metod kan tillämpas på alla mål för genetiska validering och terapeutisk utveckling.
Abstract
Demonstration av tyrosinkinashämmare (TKI) vid behandling av kronisk myeloisk leukemi (KML) har inneburit en ny era i cancer therapeutics. Dock reagerar en liten population av celler inte på TKI-behandling, vilket resulterar i minimal residual sjukdom (MRD); även de mest potenta TKI misslyckas att utrota dessa celler. Dessa MRD celler fungera som en reservoar att utveckla resistens mot behandlingen. Varför TKI behandling är ineffektivt mot MRD celler är inte känt. Tillväxtfaktor signalering är inblandad i att stödja överlevnad av MRD celler under behandling med TKI, men en mekanistisk förståelse saknas. Nyligen genomförda studier visat att ett förhöjt c-Fos och Dusp1 uttryck till följd av konvergerande onkogena och tillväxtfaktor signalering i MRD celler medla TKI motstånd. Genetiska och kemiska hämning av c-Fos och Dusp1 återger CML utsökt känslig för TKI och botar CML i både genetiska och humaniserad musmodeller. Vi har identifierat dessa målgener med flera microarrays från TKI-känslig och -resistenta celler. Här, tillhandahåller vi metoder för målet validering med hjälp av in vitro- och in vivo musmodeller. Dessa metoder kan enkelt tillämpas på alla mål för genetiska validering och terapeutisk utveckling.
Introduction
Konstituerande tyrosin Kinas aktivitet av BCR-ABL1 fusion onkogen orsakar KML, vilket ger en logik för att rikta kinase aktiviteten av liten molekyl-hämmare. TKI framgång vid behandling av patienter med KML revolutionerat begreppet riktad terapi1,2. Därefter utvecklades mot Kinas behandling som precision medicin för flera andra maligniteter, inklusive solida tumörer. Hittills har mer än trettio kinashämmare godkänts av United State FDA för behandling av olika maligniteter. TKI-behandling är mycket effektiv i undertrycka sjukdomen, är det inte botande. Dessutom en liten population av cancerceller kvarstår under behandlingen: den MRD3,4,5. Även patienter som visade fullständig remission är kvar med MRD, som så småningom resultat i återfall om inte kontinuerligt undertrycks. Utrotning av MRD celler behövs därför att uppnå ett hållbart eller botande svar. CML representerar en värdefull paradigm för att definiera begreppet precision medicin, mekanismer för Onkogenes, rationella mål-regisserad therapeutics, sjukdomsprogression och läkemedelsresistens. Dock även i dag, den mekanism som driver TKI-inducerad celldöd i cancerceller är inte helt klarlagt, inte heller varför MRD celler (bestående av leukemiska stamceller [LSCs]) är naturligt resistenta mot TKI4,6. Ändå är fenomenet ”onkogen beroende” till mutant kinase onkoprotein inblandad i TKI effekt där akut hämning av riktade onkogen av TKI orsakar en onkogen chock som leder till en massiv proapoptotiska svar eller rofylld i cell innehållsberoende sätt6,7,8,9. Dock saknas den mekanistiska basen av onkogen beroende. Nyligen genomförda studier har inblandade att tillväxtfaktor signalering upphäver onkogen beroende och följaktligen ger resistens mot TKI terapi10,11,12. Därför, för att få inblick i mekanismen av onkogen beroende har vi utfört helgenom-uttryck profilering från BCR-ABL1 beroende och nonaddicted celler (vuxit med tillväxtfaktorer), som visade att c-Fos och Dusp1 är viktiga mediatorer av onkogen missbruk13. Genetiska strykningen av c-Fos och Dusp1 är syntetiska dödliga för BCR-ABL1-uttryckande celler och de möss som används i experimentet utvecklade inte leukemi. Dessutom botade hämning av c-Fos och DUSP1 av liten molekyl-hämmare BCR-ABL1-inducerad CML i möss. Resultaten visar att nivåerna av c-Fos och Dusp1 definiera apoptotiska tröskeln i cancerceller, så att lägre nivåer ger drogen känslighet medan högre nivåer orsakar resistens mot behandling13.
För att identifiera de gener som kör onkogen beroendet, utfört vi flera helgenom-uttryck profilering experiment i närvaro av tillväxtfaktor och en TKI (imatinib) med både mus- och CML patientderiverade celler (K562). Dessa uppgifter analyseras parallellt med KML patienten datauppsättningar som erhållits från CD34+ hematopoetiska stamceller före och efter behandling med imatinib. Denna analys visade tre gener (en transkriptionsfaktor [c-Fos], dubbla specificitet fosfatas 1 [Dusp1], och en RNA-bindande protein [Zfp36]) som är vanligen uppreglerad i TKI-resistenta celler. För att validera betydelsen av dessa gener i ge läkemedelsresistens, genomförde vi steg för steg in vitro- och in-vivo analys. Uttrycksnivåerna av dessa gener bekräftades av realtids qPCR (RT-qPCR) och western blotting i resistenta celler. Ytterligare, cDNA överuttryck och Nedslagning av shRNA hårnålar av c-Fos, Dusp1, och Zfp36 visade att förhöjt c-Fos och Dusp1 uttryck är tillräckligt och nödvändigt att TKI motstånd. Därför gjorde vi en invivo validering med musmodeller med c-Fos och Dusp1 bara. För genetiska validering av c-Fos och Dusp1, vi skapade ROSACreERT-inducerbara c-Fosfl/fl möss (villkorlig knockout)14 och korsade dem med Dusp1– / – (raka knockout)15 att göra ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1– / – dubbel-transgena möss. Benmärg-derived c-Kit+ celler (från c-Fosfl/fl-, Dusp1– / –-, och c-Fosfl/flDusp1– / –) uttrycker BCR-ABL1 var analyserade i vitro i kolonibildande enhet (CFU) analys och i vivo av benmärgstransplantation i dödligt bestrålade möss, testa kravet på c-Fos och Dusp1 ensamma eller tillsammans i leukemi utveckling. Likaså de kemiska hämningar av c-Fos av DFC (difluorinated curcumin)16 och Dusp1 av BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 testades in vitro och in vivo med BCR-ABL1-uttrycker, ben benmärg-derived c-Kit+ celler från vildtyp (WT) musen. För att bekräfta behovet av c-Fos och Dusp1 i leukemic stamceller, utnyttjade vi en CML musmodell där BCR-ABL1 var specifikt induceras i dess stamceller av doxycyklin (Tet-transactivator uttrycker under murina stem cell leukemi (SCL) gen 3′ förstärkare förordning)18,19. Vi använde benmärgen Lin–Sca+c-Kit+ (LSK) celler från dessa möss i ett invivo transplantation test. Dessutom vi etablerat phopsho-p38 nivåer och uttrycket av IL-6 som farmakodynamiska biomarkörer för Dusp1 och c-Fos hämning, respektive i vivo. Slutligen, för att utöka studien för människors relevans, patientderiverade CD34+ celler (motsvarande i c-Kit+ celler från möss) var utsätts för långsiktiga in vitro-kultur-inleda cell analyser (LTCIC) och en i vivo humaniserad musmodell av CML20,21. Nedsatt immunförsvar mössen transplanterades med KML CD34 + celler, följt av läkemedelsbehandling och analys av mänsklig leukemic cellöverlevnad.
I detta projekt utvecklar vi metoder för target identifiering och validering med hjälp av både genetiska och kemiska verktyg använder olika prekliniska modeller. Dessa metoder kan användas framgångsrikt för att validera andra mål som utveckling av kemiska för terapeutisk utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
För huvuddelen av cancerceller medieras det terapeutiska svaret till TKI av en blockad av tyrosin-Kinas-onkoprotein signaler som tumören är beroende av. Dock är relativt lite känt om hur en minoritet av cancerceller som bidrar till MRD fly onkogen beroende och terapi4. Senare studier visade att tillväxtfaktor signalering förmedlar resistens i både leukemi och solida organ tumörer. Detta tyder på att olika molekylära mekanismer kan ligga till grund för inneboende motstånd<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma att G. Q. Daley för att ge de BaF3 och WEHI cellerna och T. Reya för den MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruerar. Författarna är tacksam till M. Carroll för att tillhandahålla patientproverna från den CML blastkris. Denna studie stöddes av bidrag till M.A. från NCI (1RO1CA155091), leukemi Research Foundation och V stiftelse, och från NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5mg/ml stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2X HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet ( boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II ( FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I ( FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII ( FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O’Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and “oncogenic shock”. Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes–the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- . Qiagen-miRNAeasy kit Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018)
- . DNA-free DNA removal kit Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018)
- . SuperScript™ III First-Strand Synthesis System Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018)
- . Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018)
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
