Her presenterer vi en metode der menneskelige lav nøytrofile (LDN), utvinnes fra postoperativ peritoneal lavage væske, produsere massive nøytrofile ekstracellulære feller (nett) og effektivt felle gratis kreftceller som senere vokser.
Aktivert nøytrofile utgivelsen nøytrofile ekstracellulære feller (nett), som kan fange og ødelegge mikrober. Nyere studier tyder på at garn er involvert i ulike sykdommer prosesser, som autoimmun sykdom, blodpropp og svulst metastaser. Her viser vi en detaljert i vitro -teknikk for å oppdage netto aktivitet under fangst av gratis kreftceller, som vokser etter vedlegg til garn. Først samlet vi lav tetthet nøytrofile (LDN) fra postoperativ peritoneal lavage væske fra pasienter som gjennomgikk laparotomies. Kortsiktige dyrking av LDN resulterte i massive netto formasjon som var visualisert med grønne fluorescerende kjernefysiske og kromosom counterstain. Etter co inkubasjonstiden for menneskelig magekreft cellelinjer MKN45 og OCUM-1 NUGC-4 med garn, ble mange kreftceller fanget av garn. Deretter vedlegget ble helt avskaffet av nedbrytning av garn med DNase I. Time-lapse video avslørt at kreftceller fanget av garn ikke dø, men i stedet vokste kraftig i en kontinuerlig kultur. Disse metodene kan brukes til deteksjon av selvklebende interaksjoner mellom garn og ulike typer celler og materialer.
Polymorph kjernefysiske nøytrofile i sirkulerende blod er vanligvis atskilt fra mononukleære celler gjennom metoden tetthet gradert forberedelse. Det er imidlertid noen nøytrofile kjent som lav nøytrofile (LDN), med CD11b(+), CD15(+), CD16(+) og CD14(-) fenotyper, co renset med mononukleære celler. Den relative antallet LDN øker betraktelig i ulike pathological betingelser inkludert autoimmune sykdommer1,2, sepsis3og kreft4,5. Tidligere studier har vist at LDN er en svært og funksjonelt klasse av nøytrofile6. Det bør bemerkes at LDN i sirkulerende blod er mer sannsynlig å produsere nøytrofile ekstracellulære feller (nett) enn normal tetthet nøytrofile2,7. Nettene er web-lignende strukturer består av atomer syren, histones, proteaser og detaljert og cytosolic proteiner, og de kan effektivt lure og ødelegge patogener8.
Garn har nylig vist å fange ikke bare mikrober, men også blodplater og sirkulerende kreftceller som kan hjelpe til blodpropp dannelse9 og tumor metastaser10,11. Men er molekylære mekanismer bak selvklebende samspillet mellom garn og blodplater eller tumorceller fortsatt uklart. Flere nylig, i vitro vedheft analysen viste at myelogen leukemi cellene (K56212) og lunge karsinom (A54913) knytter til nett via β1 og β3 integrins. Forfatterne brukt NET lager isolert fra nøytrofile og aktivert av phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) som vedheft substrat14. Selv om denne analysen oppdages av ekte interaksjon med netto komponenter i fravær av nøytrofile, er det arguable om de “cell-free NET lager” isolert av høyhastighets sentrifugering beholder den molekylære strukturen identisk garn produsert i vivo. Nylig fant vi at peritoneal lavage væske etter abdominal kirurgi inneholdt mange eldre LDN, som genererte enorme garn og knyttet til kreftceller forårsaker peritoneal metastaser15. I denne studien undersøkte vi vellykket vedheft av kreftceller til intakt garn uten fysisk manipulasjon. Her viser vi detaljer om en teknikk for å oppdage selvklebende interaksjoner mellom garn og gratis kreftceller.
Tidligere studier har rapportert at sirkulerende kreftceller kan overlappes i netto underlag i vivo10,11. Metastatisk brystkreft celler har vist seg å stimulere nøytrofile og indusere dannelsen av garn, som hjelper i svulst cellevekst i målet orgel17. I tillegg fant vi at kortsiktige kulturer av LDN fra postoperativ lavage væsken produsert massiv garn som kunne effektivt lure kreftceller uten ytterligere stimulering<sup class=…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ms. J. Shinohara og I. Nieda for tekniske og geistlige. Også takker vi Dr. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina og Kazuya Takahashi for deres samarbeid for prøven oppkjøp i operasjonssalen. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning fra departementet for utdanning, vitenskap, sport, og kultur i Japan og Japan Society for fremme av vitenskap (17K 10606).
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |