开放补丁夹具移液器测量未搅拌边界层中的离子浓度: 流体流动对离子通道控制的启示

Summary

利用膜片钳记录, 从流体流动剪切力敏感性的角度研究了机械敏感离子通道。然而, 根据实验方案, 离子通道流体流动规律的结果可能是错误的。在这里, 我们提供了防止和纠正此类错误的方法, 并提供了理论依据。

Abstract

流体流动是控制许多生理和病理过程的重要环境刺激, 如流体流动引起的血管扩张。虽然对流体流动剪切力的生物反应的分子机制尚不完全清楚, 但流体流动介导的离子通道门控调节可能会起重要作用。因此, 利用膜片钳技术研究了离子通道的流体流动/剪切力敏感性。然而, 根据实验协议, 数据的结果和解释可能是错误的。在这里, 我们提出了流体流动相关误差的实验和理论证据, 并提供了估计、预防和纠正这些误差的方法。用填充了 3m kcl 的开放式移液器测量了 ag/agcl 参考电极与沐浴液之间的结电位变化, 然后流体流动可将液体/金属结电位转移到约 7 mv。相反, 通过测量流体流动引起的电压变化, 我们估计了未搅拌边界层中的离子浓度。在静态条件下, 细胞膜表面与 ag/agcl 参考电极或离子通道入口相邻的实际离子浓度可达到流动条件下的约30%。在浴液和参考电极之间放置琼脂糖 3 m kcl 桥可能会防止结电位移动的问题。然而, 与细胞膜表面相邻的未搅拌层效应无法以这种方式固定。在这里, 我们提供了一种用开放的膜片钳移液器测量未搅拌边界层中的实际离子浓度的方法, 强调在研究流体流动诱导的离子电流调节时使用琼脂糖盐桥的重要性。因此, 这种新的方法考虑到了未搅拌边界层中离子的实际浓度, 可以为与离子通道流体剪切应力调节有关的实验设计和数据解释提供有益的见解。.

Introduction

流体流动是控制许多生理和病理过程的重要环境提示, 如流体流动引起的血管舒张和流体剪切力依赖血管重塑和发展^{1,2, 3,4,5}。虽然对流体流动剪切力的生物反应的分子机制尚不完全清楚, 但人们认为, 流体流动介导的离子通道门控的调节可能会对流体流动引起的反应^做出重要贡献5^,6,7.,8. 例如, 在 ca^{2 +}流体流入后, 内皮内整流 kir2.1 和 ca^{2 +}激活 k⁺ (k_ca2.3, kcnn3) 通道被建议为流体的贡献流诱导的血管扩张^6,7,8。因此, 利用膜片钳技术^6、9、10对流体流动/剪切力敏感性进行了流体流动敏感性研究, 特别是机械激活或抑制通道。^,11. 然而, 根据膜片钳记录过程中执行的实验协议, 离子通道流体流动规律数据的结果和解释可能是错误^{的 10、11.}

在膜片夹具记录中, 流体流动引起的伪影的一个来源是浴液与 ag/agcl 参考电极¹¹之间的结电位。考虑到沐浴液之间的化学反应, 一般认为沐浴液与 ag/agcl 电极之间的液体金属结电位是恒定的, 因为沐浴液的 cl^浓度保持不变和 ag/agcl 电极为:

银 +^cl-agcl + 电子 (e-) (公式1)

然而, 在洗浴液与 ag/agcl 参考电极 (公式 1) 之间的整体电化学反应从左到右的情况下, 与 ag agcl 基准相邻的沐浴液的 cl^浓度电极 (未搅拌边界^{层 12,13, 14,15)}可能比洗澡溶液的大部分要低得多, 除非确保足够的对流传输。使用旧的或不理想的 ag/agcl 电极, 而银的氯化不足, 可能会增加这种风险。事实上, 在参考电极上, 这种与流体流动相关的文物可以通过简单地在沐浴液和参考电极之间放置一个传统的琼脂盐桥来排除, 因为该文物是基于真实 cl^–的改变。浓度与 ag/agcl 电极^相邻11。本研究中提出的协议描述了如何防止与流动有关的结电位变化, 并测量未搅拌边界层中的实际离子浓度。

在沐浴液和 agarose agcl 参考电极之间放置琼脂糖 kcl 桥之后, 还需要考虑另一个关键因素: 就像参考 agsl-agcl 电极的作用就像 cl^–电极一样, 离子通道也可以起到作用就像离子选择性电极在细胞外溶液和细胞内溶液之间通过膜离子通道的运动过程中, 在沐浴液和 ag/agcl 参考电极之间出现未搅拌边界层的情况。这意味着在解释流体流动对离子通道的调节时应谨慎行事。正如我们在前面的研究¹¹中所讨论的, 离子通过存在电化学梯度的溶液的运动可以通过三种不同的机制发生: 扩散、迁移和对流, 其中扩散是运动由浓度梯度引起的迁移是由电梯度驱动的运动, 对流是流体流动的运动。在这三种传输机制中, 对流模式对离子¹¹ (> 比通常的膜片钳设置下的扩散或迁移大 1, 000倍) 的运动贡献最大。这就形成了在不同的静态和流体流动条件下, 浴液与 ag/agcl 参考电极之间的结电位能非常大的理论基础¹¹。

根据上述假设, 流体流动对离子通道电流的一些促进作用可以从膜表面通道入口附近的实际离子浓度的对流恢复中推断出来 (未搅拌边界层)¹⁰. 在这种情况体流动对离子通道电流的影响只是来自电化学事件 , 而不是离子通道门控的调节。此前, 巴里和他^{的同事们根据}严格的理论考虑和实验证据, 也被称为未搅拌层或实验证据, 提出了类似的想法.运输编号效果。如果某些离子通道具有足够的单通道电导率和足够长的开放时间, 以提供足够的传输速率通过通道 (膜中的传输速率比未搅拌膜表面的传输速度更快), 则可能会产生边界层效应.因此, 对流相关的运输可以促进最终流体流动诱导的离子电流 10^,12,13,^14,15的促进。

在本研究中, 我们强调了在研究流体流动诱导的离子电流调节时使用琼脂或琼脂盐桥的重要性。我们还提供了一种测量与 ag/agcl 参考电极和膜离子通道相邻的未搅拌边界层中的实际离子浓度的方法。此外, 对流体流动诱导的离子通道电流调制 (即对流假设或未搅拌层传输数效应) 的理论解释, 可以为设计和解释对离子通道电流的研究提供有价值的见解。离子通道的剪切力调节。根据未搅拌边界层输运数效应, 我们预测, 通过流体流动可以促进所有类型的离子通道电流, 独立于其对流体流动剪切力的生物敏感性, 但前提是:离子通道具有足够的单通道电导率和较长的开时间。较高的离子通道电流密度可能会增加细胞膜表面的未搅拌边界层效应。

Protocol

所有实验都是根据 konkuk 大学的机构准则进行的。 1. 浴液与 ag/agcl 参考电极之间的琼脂糖盐桥 注: 琼脂糖 3m kcl 盐桥是按照前面所述的 12生产的, 变化不大。 桥梁的形成 弯曲火玻璃毛细管, 形成适当的 u 形。在记录大离子电流时, 毛细血管的内径应足够大, 以降低串联电阻。内径为2-5 毫米的管材通常是可以接受的。 …

Representative Results

全细胞电压依赖性 l 型 ca2 +通道 (vdcc l) 记录在酶分散的大鼠肠系膜动脉肌细胞中, 如前面所述 11.动脉肌细胞在 nystatin 穿孔结构下用富含 cs 的移液溶液透析, 并采用二价无阳离子沐浴溶液, 以促进电流通过 vdccl11,16。在-70 mv 的保持电位下, 对 vdccl 电流进行了短暂的去极化电压坡?…

Discussion

在本研究中, 我们展示了一种方法, 通过用填充高 kcl 的开放式膜片式夹钳确定液-金属连接电位, 测量与 ag/agcl 参考电极相邻的未搅拌层中的真实 cl 浓度浓度。当从静态向流体流动条件切换时, 边界层中 cl 浓度的变化会导致结电位的转移。只需在参考电极和沐浴液之间使用琼脂糖 kcl 桥, 即可防止膜片夹具记录过程中的 cl^浓度相关错误或伪影。

除了强调…

Materials

RC-11 open bath chamber	Warner instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl electrode pellet	World Precision Instruments, USA	EP1
Agarose	Sigma-aldrich, USA	A9793
Voltage-clamp amplifier	HEKA, Germany	EPC8
Voltage-clamp amplifier	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
Liquid pump	KNF Flodos, Switzerland	FEM08