Mesure de la Concentration en ions dans la couche limite stationnaire avec la Pipette ouverte Patch-Clamp : incidences sur le contrôle des canaux ioniques par Fluid Flow
Summary
Canaux ioniques Mécanosensibles est souvent étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec enregistrement patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, l’issue sur le flux de fluides-règlements des canaux ioniques peut être erronée. Ici, nous fournissons des méthodes pour prévenir et corriger ces erreurs avec une base théorique.
Abstract
Écoulement de fluide est un stimulus environnemental important qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement fluide/shear force ne sont pas totalement comprises, régulation débit liquide de blocage de canal ionique peut contribuer critique. Par conséquent, écoulement fluide/shear force sensibilité des canaux ioniques a été étudiée en utilisant la technique du patch-clamp. Toutefois, selon le protocole expérimental, les résultats et l’interprétation des données peuvent être erronées. Ici, nous présentons des preuves expérimentales et théoriques en erreurs de flux de fluide et fournir des méthodes pour l’estimation et la prévention et la correction de ces erreurs. Changements de potentiel entre l’électrode de référence Ag/AgCl et bain liquide de jonction ont été mesurées avec une pipette ouverte remplie de 3M KCl. écoulement de fluide pourrait alors déplacement le mV potentielle d’environ 7 jonction liquide/métal. À l’inverse, en mesurant le décalage de tension induit par l’écoulement du fluide, nous avons estimé la concentration en ions dans la couche limite stationnaire. À l’état statique, les concentrations d’ions real adjacentes à l’Ag/AgCl référence électrode ion canal d’entrée à la surface de la membrane cellulaire peuvent atteindre le plus bas aussi environ 30 % de ce débit. Placer un gel d’agarose 3M pont de KCl entre l’électrode de référence et fluide de baignade peut avoir empêché ce problème de jonction potentielle changeant. Toutefois, l’effet de la couche stationnaire adjacente à la surface de la membrane cellulaire ne pourrait pas fixée de cette manière. Ici, nous fournissons une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire avec une pipette ouverte patch clamp, mettant l’accent sur l’importance d’utiliser un gel d’agarose sel-pont alors qu’il étudiait les fluide régulation induite par l’écoulement de courants ioniques. Par conséquent, cette approche novatrice, qui prenne en considération les véritables concentrations des ions dans la couche limite stationnaire, peut fournir des observations utiles sur le plan expérimental et interprétation des données liées à la réglementation de la contrainte de cisaillement fluide des canaux ioniques .
Introduction
Écoulement de fluide est un important signal environnemental qui contrôle de nombreux processus physiologiques et pathologiques tels que la vasodilatation induite par le flux de fluide et cisaillement fluide force dépendant vasculaire remodelage et développement1,2, 3,4,5. Bien que les mécanismes moléculaires pour les réponses biologiques à l’écoulement du fluide force de cisaillement ne sont pas totalement comprises, on croit que régulation débit liquide de blocage de canal ionique critique contribue aux réponses induites par écoulement fluide5 , 6 , 7 , 8. par exemple, l’activation de l’endothélium redresseur entrant Kir2.1 et Ca2 +-activé K+ (KCa2.3, KCNN3) canaux après l’influx de Ca2 + par l’écoulement du fluide a été suggéré de contribuer au fluide vasodilatation induite par le flux de6,7,8. Par conséquent, de nombreux canaux ioniques, canaux spécialement activés mécaniquement ou – inhibés, ont été étudiés en termes de flux fluide/shear force sensibilité avec le patch clamp technique6,9,10 , 11. Toutefois, selon le protocole expérimental effectué au cours de l’enregistrement patch clamp, résultats et interprétation des données sur les flux de fluides-règlements des canaux ioniques peuvent être erronée10,11.
Une source d’artefacts d’induite par le flux de fluide dans l’enregistrement patch-clamp est de la jonction éventuelle entre le fluide de baignoire et d’électrode Ag/AgCl référence11. On croit généralement que la jonction liquide/métal potentielle entre le bain fluide et électrode Ag/AgCl est constante que la concentration en Cl– du bain liquide est maintenue constante, compte tenu de la réaction chimique entre la solution de trempage et électrode Ag/AgCl pour être :
AG + Cl–↔ AgCl + électron (e–) (équation 1)
Toutefois, dans un cas où la réaction électrochimique globale entre la solution de trempage et l’électrode de référence Ag/AgCl (équation 1) procède de gauche à droite, la concentration en Cl– le liquide de bain adjacente à l’Ag/AgCl référence électrode (couche limite stationnaire12,13,14,15) peut être beaucoup plus faible que dans la majeure partie de la solution, de baignade, à moins que suffisamment transport par convection est assurée. En utilisant une électrode Ag/AgCl vieux ou non idéales avec chloration insuffisante de l’Ag peut augmenter ce risque. Cet artefact axés sur les flux de fluide à l’électrode de référence, en fait, peut être exclu en plaçant simplement un pont d’agarose-sel classique entre le fluide de la baignade et la référence électrode, étant donné que l’artefact est issu des altérations en véritable Cl– concentration d’adjacente à électrode Ag/AgCl11. Le protocole présenté dans la présente étude décrit comment empêcher les changements potentiels de jonction axés sur les flux et mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire.
Après avoir placé un gel d’agarose pont de KCl entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl, il y a un autre facteur crucial qui devrait être considéré : tout comme la référence électrode Ag/AgCl agit comme une électrode Cl– , les canaux ioniques peuvent également fonctionner comme une électrode sélective des ions. La situation d’une couche limite stationnaire entre le bain fluide et l’électrode de référence Ag/AgCl se présente pendant le mouvement des ions entre les solutions extracellulaires et intracellulaires par le biais de canaux ioniques membranaires. Cela implique que l’attention doit être utilisé lors de l’interprétation de la réglementation des ions canaux par l’écoulement du fluide. Tel que mentionné dans notre précédente étude11, le mouvement des ions à travers une solution dans laquelle existe un gradient électrochimique peut se produire par l’intermédiaire de trois mécanismes distincts : diffusion, migration et convection, où la diffusion est le mouvement induite par le gradient de concentration, la migration est le mouvement conduit par gradient électrique et convection est le mouvement par le biais de flux de fluide. Parmi ces mécanismes de trois transport, mode convection qui contribue le plus à la circulation des ions11 (> 1 000 fois supérieures à la diffusion ou de la migration sous paramètres habituels patch clamp). Celui-ci constitue la base théorique de pourquoi jonction éventuelle entre le fluide de la baignade et électrode de référence Ag/AgCl peut très sous différentes conditions statiques et les flux de fluide11.
Selon l’hypothèse proposée plus haut, certains effets facilitateur de débit des fluides sur le canal ionique actuel peuvent être déduites de la convection restauration des concentrations en ion réelle adjacentes à l’entrée du canal à la surface de la membrane (couche limite stationnaire) 10. dans ce cas, les effets d’induite par le flux de fluide sur les courants des canaux ioniques ont simplement découler d’événements électrochimiques, pas de la régulation des processus de blocage de canal ionique. Une idée similaire a été précédemment suggérée par Barry et ses collègues12,13,14,15 basée sur des considérations théoriques rigoureuses et des preuves expérimentales, également connu sous le nom de la couche stationnaire ou effet numéro de transport. Si certains canaux ioniques ont suffisamment la conductance monocanal et assez longtemps ouverte-le temps de fournir des taux de transport suffisante par tous les canaux (un plus rapide taux de transport dans la membrane que dans la surface de la membrane stationnaire), un effet couche limite peuvent survenir . Ainsi, le transport par convection-dépendante peut contribuer à éventuelles facilitations induite par fluide-flux d’ion actuel10,12,13,14,15.
Dans cette étude, nous insistons sur l’importance d’utiliser une gélose ou agarose sel-pont alors qu’il étudie la régulation induite par fluide-flux des courants ioniques. Nous fournissons également une méthode pour mesurer les concentrations d’ions réel dans la couche limite stationnaire adjacente aux Ag/AgCl référence électrode et membrane canaux ioniques. En outre, l’interprétation théorique de fluide modulation induite par le flux des courants des canaux ioniques (c.-à-d., hypothèse de convection ou effet numéro de transport couche stationnaire) peut fournir des indications précieuses pour la conception et l’interprétation des études sur la force de cisaillement-règlement des canaux ioniques. Selon l’effet numéro de la transport couche limite stationnaire, nous prédisons que les courants des canaux ioniques à travers tous les types de canaux ioniques membranaires peuvent être facilitées par l’écoulement du fluide, indépendamment de leur sensibilité biologique à force de cisaillement du fluide, mais seulement si les canaux ioniques ont suffisamment monocanal conductance et ouvert long-temps. Densités de courant plus élevées ion channel peut augmenter l’effet de la couche limite stationnaire à la surface de la membrane cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons démontré une méthode pour mesurer la véritable concentration Cl– dans la couche stationnaire adjacente à l’électrode de référence Ag/AgCl en déterminant le potentiel de jonction liquide métallique avec une pipette de patch clamp ouvert remplie d’une haute KCl concentration. La variation de concentration Cl– dans la couche limite peut entraîner un changement de potentiel de jonction lors du passage du statique à des conditions de flux de fluide. Simpl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le programme de centre de recherche de Pioneer (2011-0027921), de programmes de recherche sciences fondamentales (2015R1C1A1A02036887 et 2016R1A2B4014795-NRF) par le National Research Foundation of Korea financé par le ministère de la Science, TIC & Avenir de planification et par une subvention de la Corée Health Technology R & D Project à travers la Corée santé industrie développement Institut (KHIDI), financé par le ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
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