Måling av konsentrasjon i Unstirred grensen laget med åpne Patch-klemme Pipette: implikasjoner i kontroll av Ion kanaler av væske flyt
Summary
Mechanosensitive ionekanaler er ofte studerte i form av flytende flyt/skjær force sensitivitet med patch-klemme opptak. Imidlertid avhengig av eksperimentelle protokollen, kan resultatet på flytende flyt-regler ion kanaler være feilaktige. Her gir vi metoder for å forebygge og korrigere slike feil med en teoretisk basis.
Abstract
Væskestrøm er en viktig miljømessige stimulans som styrer mange fysiologiske og patologiske prosesser, som flytende flyt-indusert vasodilatasjon. Selv om molekylære mekanismer for biologiske svar til flytende flyt/skjær styrke ikke er fullt ut forstått, bidra flytende flyt-mediert regulering av ion kanal gating kritisk. Derfor, flytende flyt/skjær force sensitivitet ion kanaler har blitt studert ved hjelp av patch-klemme teknikk. Imidlertid avhengig av eksperimentelle protokollen, kan resultater og tolkning av data være feilaktige. Her presenterer vi eksperimentelle og teoretiske bevis for flytende flyt-relaterte feil og tilby metoder for beregning, forebygge og korrigere feilene. Endringer i krysset potensielle mellom Ag/AgCl referanse elektrode og bading væske ble målt med et åpent pipette fylt med 3 M KCl. strømning kan deretter flytte væske/metal krysset potensielle til ca 7 mV. Omvendt, ved å måle spenning skiftet indusert av strømning, beregnet vi konsentrasjonen i unstirred grensen laget. Statisk tilstanden, kan de virkelige ion konsentrasjonene tilstøtende i Ag/AgCl referanse elektrode eller ion kanal innløpet på cellemembranen overflaten nå så lav som ca 30% av strømmen til tilstanden. Plassere en agarose 3 M kan KCl bro mellom bading væske og referanse elektroden ha forhindret dette problemet med junction potensielle skiftende. Men kan unstirred lageffekten ved siden av cellemembranen overflaten ikke løses på denne måten. Her gir vi en metode for å måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget med en åpen patch-klemme pipette, understreker viktigheten av å bruke en agarose salt-bro mens han studerte flytende flyt-indusert regulering av ion strøm. Derfor kan denne romanen tilnærming, som tar hensyn til de virkelige konsentrasjonene av ioner i den unstirred grenselag, gi nyttig innsikt på eksperimentell design og data tolkning relatert til flytende skjæring stress regulering av ionekanaler .
Introduction
Væskestrøm er en viktig miljømessige kø som styrer mange fysiologiske og patologiske prosesser som flytende flyt-indusert vasodilatasjon og flytende skjær kraft-avhengige vaskulære remodeling og utvikling1,2, 3,4,5. Selv om molekylære mekanismer for biologiske svar strømning skjær kraft ikke er fullt ut forstått, antas det at flytende flyt-mediert regulering av ion kanal gating kritisk kan bidra til flytende flyt-indusert svar5 , 6 , 7 , 8. For eksempel aktivering av endothelial innover likeretter Kir2.1 og Ca2 +-aktivert K+ (KCa2,3, KCNN3) kanaler etter Ca2 + tilstrømningen av væskestrøm har blitt foreslått for å bidra til væske flyt-indusert vasodilatasjon6,7,8. Derfor mange ionekanaler, særlig mekanisk aktivert eller -hemmet kanaler, har vært undersøkt i form av flytende flyt/skjær force sensitivitet med patch-klemme teknikk6,9,10 , 11. avhengig av eksperimentelle protokollen under oppdateringen-klemme opptak, resultater og tolkning av dataene på flytende flyt-regler ion kanaler kan imidlertid være feilaktige10,11.
En kilde til flytende flyt-indusert gjenstander i patch-klemme innspillingen er fra krysset potensielle mellom bad væske og Ag/AgCl referanse elektrode11. Det er generelt antatt at væske/metal krysset potensielle mellom bading væske og Ag/AgCl elektrode er konstant som Cl– konsentrasjonen av bading væsken holdes konstant, vurderer den kjemisk reaksjon mellom bading løsningen og Ag/AgCl elektrode skal:
AG + Cl–↔ AgCl + elektron (e–) (Formel 1)
Men i tilfeller der samlet elektrokjemisk reaksjon mellom bading løsningen og Ag/AgCl referanse elektrode (Formel 1) fortsetter fra venstre til høyre Cl– konsentrasjonen av bading væsken tilstøtende Ag/AgCl referanse elektroden (unstirred grenselag12,13,14,15) kan være mye lavere enn i hoveddelen av bading løsning, med mindre nok convectional transport er sikret. Bruker en gammel eller ikke-ideelle Ag/AgCl elektrode med utilstrekkelig klorering AG kan øke slik risiko. Denne flytende flyt-relaterte gjenstand på referanse elektrode, faktisk kan ekskluderes ved å plassere en vanlig agarose-salt bro mellom bading væske og referanse elektrode, siden gjenstand er basert på endringer i ekte Cl– konsentrasjon tilstøtende Ag/AgCl elektrode11. Protokollen presentert i denne studien beskriver hvordan forebygge flyt-relaterte krysset mulige endringer og måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget.
Etter å ha en agarose KCl bro mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode, det er en annen viktig faktor som bør vurderes: bare som referanse Ag/AgCl elektrode fungerer som en Cl– -elektrode, ion kanalene kan også fungere som en ion-selektiv elektrode. Situasjonen for en unstirred grenselag mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode oppstår under flytting av ioner mellom den ekstracellulære og intracellulær løsninger gjennom membranen ionekanaler. Dette innebærer at forsiktighet bør brukes når tolke regulering av ion kanaler av væskestrøm. Som nevnt i vår forrige studie11, bevegelsen av ioner gjennom en løsning der en elektrokjemisk gradering er til stede kan oppstå via tre forskjellige mekanismer: diffusjon, overføring og konveksjon, hvor spredningen er bevegelsen indusert av konsentrasjon gradient, overføringen er bevegelsen drevet av elektrisk gradering og konveksjon er bevegelsen gjennom væske-flow. Blant disse tre transportmekanismer bidrar konveksjon modus mest til bevegelsen av ioner11 (> 1000 ganger større enn spredning eller migrering under vanlige patch-klemme innstillinger). Dette danner teoretiske grunnlaget for krysset potensielle mellom bading væske og Ag/AgCl referanse elektrode kan veldig under ulike statisk og væske-flow forhold11.
Som hypotesen foreslått ovenfor noen facilitatory effekter av væskestrøm på ion kanalen gjeldende kan utledes fra konvektive restaurering av ekte ion konsentrasjoner ved kanalen innløp på membran overflaten (unstirred grenselag) 10. I dette tilfellet, flytende flyt-indusert virkningene på ion kanal strømmer har bare oppstått fra elektrokjemiske hendelser, ikke fra regulering av ion kanal gating. En lignende idé ble tidligere foreslått av Barry og kolleger12,13,14,15 basert på strenge teoretiske og eksperimentelle bevis, også kjent som unstirred laget eller transport nummer effekt. Hvis noen ionekanaler har tilstrekkelig kan enkeltkanals konduktans og lenge nok åpne-tid å skaffe tilstrekkelig transport priser gjennom kanaler (transport raskere i membranen enn i unstirred membran overflaten), en grenselag effekt oppstå . Dermed kan konveksjon-avhengige transport bidra til de endelige væske-flyt-indusert facilitations ion gjeldende10,12,13,14,15.
I denne studien vi understreke viktigheten av bruker en agar agarose salt-broen mens han studerte væske-flyt-indusert regulering av ion strøm. Vi tilbyr også en metode for å måle virkelige ion konsentrasjoner i unstirred grensen laget ved Ag/AgCl referanse elektrode og membran ion kanalene. Videre kan teoretisk tolkningen av flytende flyt-indusert modulering av ion kanal strøm (dvs. konveksjon hypotesen eller unstirred transport nummer effekt) gi verdifull innsikt for utforming og tolke studier på Skjær kraft-regulering av ionekanaler. Ifølge unstirred grenselag transport nummer effekten forutsi vi at ion kanal strømmer gjennom alle typer membran ionekanaler kan ordnes av strømning, uavhengig av deres biologiske følsomhet strømning skjær force, men bare hvis ion kanalene har tilstrekkelig enkeltkanals konduktans og åpen-lenge. Høyere ion kanal gjeldende tettheter kan øke unstirred grenselag effekten på cellemembranen overflaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien viste vi en metode for å måle virkelige Cl– konsentrasjon i unstirred laget ved den Ag/AgCl referanse elektroden ved å bestemme flytende-metallisk krysset potensial med en åpen patch-klemme pipette fylt med en høy KCl konsentrasjon. Endringen i Cl– konsentrasjon i grenselag kan resultere i et skifte av krysset potensialet når du bytter fra statiske til væske-strømningsforhold. Å bruke en agarose KCl bro mellom referanse elektrode og bading væske kan hindre Cl– ko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av Pioneer Research Center programmet (2011-0027921), av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammer (2015R1C1A1A02036887 og NRF-2016R1A2B4014795) gjennom National Research Foundation av Korea finansiert av departementet for vitenskap, IKT & Fremtiden planlegging, og av en bevilgning av Korea helse teknologi R & D prosjektet gjennom Korea helse industri Development Institute (KHIDI), finansiert av helse og velferd, Sør-Korea (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- . A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018)
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
