Использование Autometallography для локализации и полу количественно серебра в тканях китообразных
Summary
Протокол представлен autometallography для локализации Ag в китообразных тканях печени и почек. Кроме того новый пробирного, названный китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа) разработана для оценки концентраций Ag в этих тканях.
Abstract
Наночастиц серебра (AgNPs) широко используются в коммерческих продуктов, включая текстиль, косметики и медицинских пунктов, их сильным антимикробным воздействием. Они также могут попадать в окружающую среду и накапливаются в океане. Таким образом AgNPs являются основным источником загрязнения Ag, и повышение осведомленности общественности о экологической токсичности Ag. Предыдущие исследования показали биоаккумуляции (в производителей) и масштаб (в потребителей/хищников) АГ. Китообразных, как Апекс хищников океана, может отрицательно сказались Ag/Ag соединений. Хотя концентрации соединений Ag/Ag в тканях китообразных могут быть измерены индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии (ICP-MS), использование ICP-MS ограничивается его высокие капитальные затраты и требования для хранения/Подготовка тканей. Таким образом autometallography (AMG) метод с количественный анализ изображений с помощью формалин исправлена, парафин врезанных тканей (FFPE) может быть методом адъювант для локализации Ag распределения на уровне скупщиков и оценки концентрации Ag в китообразных тканей. Позитивные сигналы AMG основном коричневый черный гранул различных размеров в цитоплазме проксимальных почечных трубчатых эпителия, гепатоцитов и клеток Купфера. Иногда некоторые аморфного золотисто-желтый коричневый AMG позитивные сигналы, отмечены в просвет и базальной мембраны некоторых проксимальных почечных канальцев. Анализа для оценки концентрации Ag называется Пробирной гистологического Ag китообразных (Чаа), который представляет собой модель регрессии, установленные данным изображения количественный анализ метода AMG и ИСП-МС. Использование AMG с Чаа локализовать и полу количественную оценку тяжелых металлов обеспечивает удобный методологии для исследования пространственно временных и кросс видов.
Introduction
Наночастиц серебра (AgNPs) широко используются в коммерческих продуктов, в том числе текстильных изделий, косметики и медицинских пунктов, из-за их большой антимикробным эффекты1,2. Таким образом производство AgNPs и количество продуктов, содержащих ССПС увеличиваются за время3,4. Однако AgNPs может быть выпущено в окружающую среду и накапливаются в океан5,6. Они стали основным источником загрязнения Ag, и повышение осведомленности общественности о экологической токсичности Ag.
Статус AgNPs и Ag в морской среды является сложной и постоянно меняющейся. Предыдущие исследования показали, что AgNPs могут оставаться, частицы, совокупные, распустить, реагируют с различных химических видов или регенерироваться из ионов Ag+ ,78. Несколько типов соединений Ag, например AgCl, были найдены в морских отложениях, где они могут быть ingested бентических организмов и ввести в пищевой цепи9,10. По словам предыдущего исследования, проведенного в районе лагуны Чи ку вдоль юго-западного побережья Тайваня Ag концентрации морских отложениях являются крайне низкими и похож на коре, и те из ткани печени рыб, как правило, ниже обнаружения ограничение (< 0,025 мкг/г мокрой/мокрый)11. Однако предыдущие исследования, проведенные в различных странах продемонстрировали относительно высокие концентрации Ag в печень китообразных12,13. Концентрация Ag в печень китообразных зависит от возраста, предполагая, что источник Ag в их тела, скорее всего их добычей12. Эти выводы далее предложить биоусиления Ag в животных на более высоких трофических уровнях. Китообразных, как Апекс хищников в океане, возможно, страдал негативных медицинских последствий, вызванных Ag/Ag соединений12,,1314. Самое главное как китообразных, люди являются млекопитающие и негативных медицинских последствий, вызванных Ag/Ag соединений в китообразных могут возникнуть также в организме человека. Другими словами китообразных могут быть дозорных животных для здоровья людей и морской среды. Таким образом воздействие на здоровье человека, тканей распределение и концентрация Ag в китообразных, большую озабоченность.
Хотя концентрации соединений Ag/Ag в тканях китообразных могут быть измерены индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии (ICP-MS), использование ICP-MS ограничивается его высокие капитальные затраты (инструмент и содержание) и требования для хранения тканей /Preparation12,15. Кроме того обычно трудно собирать образцы всеобъемлющей тканей во всех расследованиях случаев мель китообразных из-за материально-технические трудности, нехватка людских ресурсов и нехватка соответствующих ресурсов12. Замороженные ткани проб для анализа ICP-MS хранятся не легко из-за ограниченного холодильного пространства, и образцы замороженные ткани может отказаться из-за сломанной холодильное оборудование12. Эти вышеупомянутые препятствия мешают исследования уровней загрязнения в тканях китообразных ICP-MS анализа с использованием образцов замороженные ткани. В отличие от фиксированной образцы тканей формалином сравнительно легко собирать в ходе патанатомия мертвых мель китообразных. Таким образом необходимо разработать простой в использовании и недорогой метод для обнаружения/мера тяжелых металлов в китообразных тканей с помощью фиксированной образцы тканей формалином.
Хотя скупщиков распределения и концентрации щелочных и щелочноземельных металлов могут быть изменены во время формалин исправлена, парафин врезанных (FFPE) процесс, только меньшее воздействие на переходных металлов, таких как Ag, было отмечено16. Следовательно FFPE ткани рассматривался как идеальный образец ресурс для металлических локализации и измерения16,17. Autometallography (AMG), гистохимические процесса, может усиливать тяжелых металлов как переменно размера золотисто-желтый черный AMG позитивные сигналы на разделах ткани FFPE, и эти усиленные тяжелые металлы могут быть визуализированы под световой микроскопии18, 19 , 20 , 21. Следовательно, метод AMG предоставляет информацию о скупщиков распределения тяжелых металлов. Он может обеспечить важную дополнительную информацию для изучения метаболических тяжелых металлов в биологических системах, потому что ICP-MS можно измерить только концентрация тяжелых металлов на уровне органов18. Кроме того программное обеспечение для анализа цифровых изображений, таких как ImageJ, был применен к анализу количественного гистологический ткани разделы22,23. Переменно размера золотисто-желтый черный AMG позитивные сигналы разделов ткани FFPE могут быть количественно и использованы для оценки концентраций тяжелых металлов. Хотя абсолютная концентрация Ag не может непосредственно определяется метод AMG с количественного анализа изображений, она может быть оценена путем регрессионной модели, основанные на данных, полученных от количественного анализа изображений и ICP-MS, которая называется китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа). Учитывая трудности измерения концентрации Ag путем анализа ICP-MS в наиболее затруднительном положении китообразных, Чаа является ценным адъювантной методом для оценки концентраций Ag в китообразных тканях, которые не могут быть определены ICP-MS анализа из-за отсутствия замороженная образцы тканей. Этот документ описывает протокол гистохимический метод (метод AMG) для локализации Ag на уровне скупщиков и assay именем Чаа для оценки концентраций Ag в тканях печени и почек китообразных.
Рисунок 1: схема, изображающие установление и применение китообразных Пробирной гистологического Ag (Чаа) для оценки концентрации Ag. Чаа = китообразных Пробирной гистологического Ag, FFPE = формалин исправлена, парафин врезанных, ИСП-МС = индуктивно связанной плазмы масс-спектроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Цель статьи исследования является установить метод адъювантной оценить распределение Ag на уровнях скупщиков и оценить Ag концентрации в тканях китообразных. Текущий протоколы включают в себя 1) определение концентраций Ag в китообразных тканей ICP-MS, 2) AMG анализ образцов тканей, пара согл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Тайвань китообразных мель сети для сбора и хранения, в том числе китообразных общество Тайвань, Taipei; Китообразных научно-исследовательская лаборатория (профессор Лянь Сян Chou), Институт экологии и эволюционной биологии, Национальный университет Тайваня, Тайбэй; Национальный музей естественных наук (доктор Chiou Цзюй Яо), Тайчжун; и морской биологии и китообразных научно-исследовательский центр, Национальный университет Ченг Кунг. Мы также благодарим бюро лесного хозяйства, Советом сельского хозяйства, Исполнительный юань для их разрешения.
Materials
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | — | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers?. Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , 167-230 (2005).
- Shih, C. -. C., Liu, L. -. L., Chen, M. -. H., Wang, W. -. H. . Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
