En kromatin Immunoprecipitation analyse til at identificere nye NFAT2 Target gener i kronisk lymfatisk leukæmi
Summary
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) er den mest almindelige leukæmi i den vestlige verden. NFAT transkriptionsfaktorer er vigtige regulatorer af udvikling og aktivering i talrige celletyper. Vi præsenterer her, en protokol til brug af kromatin immunoprecipitation (ChIP) i humane CLL celler til at identificere nye mål gener af NFAT2.
Abstract
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) er karakteriseret ved udvidelse af maligne B celle kloner og repræsenterer den mest almindelige leukæmi i de vestlige lande. Fleste CLL patienter vise en indolent løbet af sygdommen samt en anergic Fænotypen af deres leukæmiceller, henviser til en B-celle receptoren ikke reagerer på eksterne stimulation. Vi har for nylig vist, at transkriptionsfaktor NFAT2 er en afgørende regulator af anergy i CLL. En stor udfordring i analysen af rollen, som en transkriptionsfaktor i forskellige sygdomme er identifikation af dets særlige mål gener. Dette er af stor betydning for belysning af patogenetisk mekanismer og potentielle terapeutiske indgreb. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) er en klassisk teknik til at påvise protein-DNA interaktioner og kan derfor anvendes til at identificere direkte mål gener af transkriptionsfaktorer i pattedyrsceller. Her, blev ChIP brugt til at identificere LCK som et direkte mål gen af NFAT2 i CLL menneskeceller. DNA og tilknyttede proteiner er crosslinked ved hjælp af formaldehyd og efterfølgende forskydes ved hjælp af sonikering i DNA fragmenter af cirka 200-500 basepar (bp). Tværbundet DNA fragmenter forbundet med NFAT2 er derefter selektivt immunoprecipitated fra celle debris ved hjælp af en αNFAT2 antistof. Efter rensning, er tilknyttede DNA fragmenter fundet via kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydelig berigelse repræsenterer områder af genomet, som er ramt af NFAT2 i vivo. Passende klipning af DNA og udvælgelsen af de påkrævede antistof er særligt afgørende for vellykket anvendelse af denne metode. Denne protokol er ideel til demonstration af direkte samspillet mellem NFAT2 med target gener. Dens store begrænsning er svært at ansætte ChIP i storstilet assays analysere target gener af flere transkriptionsfaktorer i intakt organismer.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) repræsenterer den mest almindelige leukæmi hos voksne i de vestlige lande, udstiller forskellige ophobning af CD19, CD23 og CD5 at udtrykke modne B-celler1. De fleste patienter udviser en indolent sygdomsforløb, som ikke kræver særlig behandling i mange år. Derimod viser nogle patienter hurtig progression kræver øjeblikkelig terapeutiske indgreb med immun-kemoterapi eller andre målrettede behandlinger2,3. Nukleare faktor af aktiverede T-celler (NFAT) er en familie af transskriptionsfaktorer kontrollerende forskellige udviklingsmæssige og aktivering processer i talrige celle typer4,5,6. Vi har for nylig vist overekspression og konstitutionelle aktivering af NFAT2 i CLL celler fra patienter med indolent sygdom7. Her, regulerer det en tilstand til B-celle receptoren stimulation kaldet anergy7. For at vise, at NFAT2 binder sig til lymfocyt-specifikke protein tyrosin kinase (LCK) promotor og regulerer LCK udtryk i menneskets CLL celler, en specifik kromatin immunoprecipitation assay blev (ChIP) udviklet og ansat.
Chippen er en af de flere teknikker til at undersøge rollen af transkriptionsfaktorer i gen expression8. Genekspression er stramt orkestreret i en meget kompliceret måde af flere tilsynsmyndigheder med transskriptionsfaktorer at tage en uerstattelig rolle i denne proces9,10,11,12. Transkriptionsfaktorer regulering genekspression i rumlige og tidsmæssige sammenhæng er blevet påvist i talrige arter (f.eks. til udvikling og differentiering)13,14,15, 16,17,18. Fejl i de indviklede kontrolmekanismer, der involverer transskriptionsfaktorer kan føre til en række forskellige patologiske processer, herunder kræft19,20. Derfor, identifikation af transkriptionsfaktorer og deres respektive mål kunne tilbyde nye terapeutiske muligheder21,22. For at undersøge dette spændende felt fås flere metoder som ChIP, elektroforese mobilitet Skift assay (EMSA), forskellige DNA pull-down assays og reporter-assays8,11,12, 23 , 24.
For at demonstrere, at en bestemt transkriptionsfaktor interagerer med specifikke områder af genomet er in vivo ChIP en ideel teknik25. Til dette formål, er DNA og tilknyttede proteiner i levende celler krydskædet, ved hjælp af UV-bestråling eller formaldehyd (krydsbundet ChIP, XChIP). Dette trin er udeladt at opnå bedre DNA og protein opsving i den såkaldte native ChIP (NChIP)26. DNA-protein komplekser er efterfølgende forskydes ved hjælp af sonikering i fragmenter af cirka 200-500 basepar (bp) og immunoprecipitated fra celle debris ved hjælp af et specifikt antistof mod transkriptionsfaktor af interesse. De tilknyttede DNA fragmenter er derefter renset og karakteriseret ved PCR, kloning af molekylære og sekventering. Alternative teknikker bruge microarrays (ChIP-on-Chip) eller næste generation sequencing (ChIP-Seq) til at analysere immunoprecipitated DNA.
ChIP blev først indført af Gilmour og Lis i 1984, hvornår de brugte UV lys til kovalent cross-link DNA og bundet proteiner i levende bakterier27. På celle lysis og immunoprecipitation af bakterielle RNA polymerase, blev specifikke sonder i kendte gener brugt til at tilknytte i vivo fordelingen og tæthed af RNA-polymerase. Metoden blev efterfølgende brugt af samme efterforskerne for at analysere fordelingen af eukaryote RNA polymerase II på heat shock protein gener i Drosophila28. XChIP analysen blev yderligere raffineres af Varshavsky og kolleger, der først bruges formaldehyd cross-linking for at studere sammenslutningen af Histon H4 med heat shock protein gener29,30. Den NChIP tilgang, der bærer fordelen ved en bedre DNA og protein opsving på grund af naturligt intakt epitoper og derfor større antistof specificitet, blev første gang beskrevet af Hebbes og kolleger i 198831.
Fordel af ChIP i forhold til andre teknikker til at analysere DNA-protein interaktioner er faktisk, at den faktiske samspil af en transkriptionsfaktor kan være undersøgte i vivo og ingen sonder eller kunstige betingelser skabt af buffere eller geler er ansat8,11,12. Ved at kombinere ChIP med næste generation sequencing, kan blive identificeret flere mål samtidig.
Store begrænsninger af denne teknik er den begrænsede anvendelighed for storstilet assays i intakt organismer25. Analyse af differential gen expression mønstre kan også være udfordrende ved hjælp af ChIP teknikker, hvis de respektive proteiner udtrykkes kun på lavt niveau eller under smalle tidsvinduer. En anden potentielt begrænsende faktor er tilgængeligheden af en passende antistof velegnet til ChIP11.
ChIP protokollen præsenteres her kan være ansat i vivo identifikation af target gener af en transkriptionsfaktor ved kvantitative real-time PCR (qRT-PCR). Specifikt, var målet at identificere nye mål gener af NFAT2 i CLL. ChIP blev valgt på grund af dets potentiale til at direkte vise bindingen af NFAT2 til regionerne promotor af forskellige mål gener under naturlige forhold i CLL patienten menneskeceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kritiske trin for at udføre en vellykket ChIP assay er udvælgelsen af en passende antistof og optimering af kromatin klipning proces25. Udvælgelsen af αNFAT2 antistof viste sig for at være særligt udfordrende under udviklingen af denne protokol. Mens der er flere αNFAT2 antistoffer kommercielt tilgængelige, og fleste af disse virker fint for western blotting og andre programmer, var klon 7A6 den eneste antistof, som med held kan anvendes til ChIP7. Selv angivelig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af DFG give MU 3340/1-1 og Deutsche Krebshilfe give 111134 (begge tildeles M.R.M.). Vi takker Elke Malenke for fremragende teknisk bistand).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
