Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica
Summary
Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è la leucemia più comune nel mondo occidentale. Fattori di trascrizione NFAT sono importanti regolatori dello sviluppo e attivazione in numerosi tipi cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per l’uso di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule CLL umane per identificare geni di nuovi target di NFAT2.
Abstract
Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è caratterizzata dall’espansione di cloni di cellule B maligne e rappresenta la leucemia più comune nei paesi occidentali. La maggior parte dei pazienti affetti da LLC Mostra un corso indolent della malattia così come un fenotipo anergic delle loro cellule di leucemia, riferendosi a un recettore delle cellule B non risponde a stimoli esterni. Abbiamo recentemente dimostrato che il fattore di trascrizione NFAT2 è un regolatore cruciale di anergy in CLL. Una sfida importante nell’analisi del ruolo del fattore di trascrizione in diverse malattie è l’identificazione dei suoi geni bersaglio specifico. Questo è di grande importanza per la delucidazione dei meccanismi patogenetici e gli interventi terapeutici potenziali. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è una tecnica classica per dimostrare le interazioni proteina-DNA e può, pertanto, essere utilizzato per identificare i geni bersaglio diretto di fattori di trascrizione nelle cellule dei mammiferi. Qui, ChIP è stata usata per identificare LCK come un gene bersaglio diretto di NFAT2 in cellule CLL umane. DNA e proteine associate sono reticolati con formaldeide e successivamente Tosato di sonicazione in frammenti di DNA di circa 200-500 paia di basi (bp). Reticolato frammenti di DNA associati NFAT2 sono quindi selettivamente immunoprecipitata da detriti cellulari usando un anticorpo di αNFAT2. Dopo la purificazione, frammenti di DNA associati vengono rilevati tramite PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Sequenze di DNA con evidente arricchimento rappresentano regioni del genoma che sono mirate per NFAT2 in vivo. Tosatura appropriato del DNA e la selezione dell’anticorpo richiesto sono particolarmente cruciale per la riuscita applicazione di questo metodo. Questo protocollo è ideale per la dimostrazione di interazioni dirette di NFAT2 con geni bersaglio. Il suo limite principale è la difficoltà di impiegare ChIP nelle analisi su larga scala, analizzando i geni bersaglio di più fattori di trascrizione negli organismi intatti.
Introduction
Leucemia linfocitaria cronica (CLL) rappresenta la leucemia più comune negli adulti nei paesi occidentali, che esibiscono distinto accumulo di CD19, CD23 e CD5 esprimendo maturo B cellule1. Maggior parte dei pazienti mostrano un decorso indolente, che non necessitano di un trattamento specifico per molti anni. Al contrario, alcuni pazienti mostrano progressione rapida che richiedono immediati interventi terapeutici con immunitario-chemioterapia o altre terapie mirate2,3. Fattore nucleare delle cellule di T attivate (NFAT) è una famiglia di fattori di trascrizione che controllano vari inerente allo sviluppo e processi di attivazione in numerose cellule tipi4,5,6. Recentemente abbiamo dimostrato la sovraespressione e attivazione costituzionale di NFAT2 in cellule di CLL da pazienti con malattia indolente7. Qui, regola uno stato non rispondono alla stimolazione del recettore delle cellule B chiamato anergy7. Per dimostrare che NFAT2 si lega al promotore del linfocita specifico proteina tirosina chinasi (LCK) e regola l’espressione di LCK in cellule umane di CLL, un’analisi di immunoprecipitazione della cromatina specifici (ChIP) è stato sviluppato e impiegato.
ChIP è una delle diverse tecniche per studiare il ruolo dei fattori di trascrizione genica espressione8. Espressione genica è strettamente orchestrato in un modo molto complesso da parecchi regolatori con fattori di trascrizione prendendo una parte insostituibile in questo processo9,10,11,12. Fattori di trascrizione che regolano l’espressione genica in un contesto spaziale e temporale sono state identificate in numerose specie (ad es., per lo sviluppo ed il differenziamento)13,14,15, 16,17,18. Errori nei meccanismi di controllo intricato che coinvolgono fattori di trascrizione possono condurre ad una varietà di processi patologici compreso cancro19,20. Quindi, identificazione dei fattori di trascrizione e i rispettivi obiettivi potrebbe offrire nuove vie terapeutiche21,22. Per studiare questo campo intrigante diversi metodi sono disponibili come ChIP, analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA), vari saggi di pull-down di DNA e reporter-saggi8,11,12, 23 , 24.
Per dimostrare che un certo fattore di trascrizione interagisce con regioni specifiche del genoma in vivo ChIP è una tecnica ideale25. Per questo scopo, DNA e proteine associate in cellule viventi sono reticolate mediante irradiazione UV o formaldeide (ChIP con collegamenti incrociati, XChIP). Questo passaggio viene omesso per ottenere migliore DNA e proteina recupero nel cosiddetto nativo ChIP (NChIP)26. I complessi della DNA-proteina sono successivamente tranciati di sonicazione in frammenti di circa 200-500 paia di basi (bp) e immunoprecipitati dai detriti cellulari utilizzando un anticorpo specifico contro il fattore di trascrizione di interesse. I frammenti di DNA associati sono quindi purificati e caratterizzati da PCR, clonazione molecolare e sequenziamento. Tecniche alternative utilizzano microarrays (ChIP-on-Chip) o il sequenziamento di nuova generazione (ChIP-Seq) per analizzare il DNA immunoprecipitato.
ChIP è stato introdotto da Gilmour e Lis nel 1984 quando usati UV luce a legame covalente del DNA cross-link e associato a proteine in vita batteri27. Dopo la lisi cellulare e immunoprecipitazione della RNA polimerasi batterica, sonde specifiche di geni noti sono state usate per mappare la distribuzione in vivo e la densità della RNA polimerasi. Il metodo è stato successivamente utilizzato dai ricercatori stessi per analizzare la distribuzione della polimerasi II del RNA eucariotica su geni di proteina shock termico in Drosophila28. Il dosaggio di XChIP fu ulteriormente perfezionato da Varshavsky e colleghe che usò il formaldeide cross-linking per studiare l’associazione dell’istone H4 con heat shock protein geni29,30. L’approccio di NChIP, che porta il vantaggio di un migliore recupero di DNA e proteine a causa di epitopi naturalmente intatti e, pertanto, una maggiore specificità dell’anticorpo, in primo luogo è stato descritto da Hebbes e colleghi nel 198831.
Il vantaggio del ChIP rispetto ad altre tecniche per analizzare le interazioni della DNA-proteina è, infatti, che l’interazione effettiva di un fattore di trascrizione può essere studiato in vivo e senza sonde o condizioni artificiali create da buffer o gel sono impiegato8,11,12. Combinando il ChIP con sequenziamento di nuova generazione, obiettivi multipli possono essere identificati simultaneamente.
Principali limitazioni di questa tecnica sono sua applicabilità limitata ai saggi su larga scala in organismi intatto25. L’analisi dei pattern di espressione genica differenziale può anche essere impegnativo utilizzando tecniche di ChIP se le rispettive proteine sono espresse solo a livelli bassi o finestra temporale stretto. Un altro fattore potenzialmente limitante è la disponibilità di un anticorpo appropriato adatto per ChIP11.
Il protocollo di ChIP qui presentato possa essere impiegato per l’identificazione in vivo dei geni bersaglio di un fattore di trascrizione mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). In particolare, l’obiettivo era di identificare nuovi target geni di NFAT2 in CLL. ChIP è stato scelto per il suo potenziale per dimostrare direttamente l’associazione di NFAT2 per le regioni promotrici dei geni bersaglio diverse condizioni naturali in cellule umane del paziente di CLL.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici di esecuzione di un test di ChIP successo sono la selezione di un anticorpo appropriato e l’ottimizzazione della cromatina tosatura processo25. La selezione dell’anticorpo αNFAT2 ha dimostrato di essere particolarmente impegnativo durante lo sviluppo del presente protocollo. Mentre ci sono parecchi anticorpi αNFAT2 disponibili in commercio e la maggior parte di questi funziona bene per macchiarsi occidentale e altre applicazioni, clone 7A6 era l’unico anticorpo che potrebbe es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal DFG concedere MU 3340/1-1 e la Deutsche Krebshilfe concedere 111134 (sia assegnato a lollo). Ringraziamo Elke Malenke per l’eccellente assistenza tecnica).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
