Une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine pour identifier les gènes cibles de nouveaux NFAT2 dans la leucémie lymphoïde chronique
Summary
Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est la leucémie la plus courante dans le monde occidental. Facteurs de transcription NFAT sont des régulateurs importants de développement et l’activation de nombreux types de cellules. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) dans les cellules humaines de CLL pour identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2.
Abstract
Leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par l’expansion des clones de cellules malignes de B et représente la leucémie la plus courante dans les pays occidentaux. La majorité des patients atteints de LLC montrent une lente évolution de la maladie ainsi qu’un phénotype anergiques de leurs cellules de la leucémie, se référant à un récepteur des cellules B ne répond pas à une stimulation externe. Nous avons récemment démontré que le facteur de transcription NFAT2 est un régulateur crucial d’anergie à CLL. Un défi majeur dans l’analyse du rôle d’un facteur de transcription dans différentes maladies est l’identification de ses gènes cibles spécifiques. Il s’agit d’une grande importance pour l’élucidation des mécanismes pathogéniques et interventions thérapeutiques potentielles. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une technique classique pour démontrer les interactions protéine-ADN et, par conséquent, permet d’identifier les gènes de la cible directe de facteurs de transcription dans des cellules de mammifères. Ici, ChIP a été utilisée pour identifier LCK comme un gène cible directe des NFAT2 dans les cellules humaines de CLL. L’ADN et protéines associées sont réticulés à l’aide de formaldéhyde et cisaillement par la suite par sonication dans des fragments d’ADN d’environ 200 à 500 paires de bases (bp). Des fragments d’ADN réticulés associés à NFAT2 sont ensuite sélectivement immunoprécipitée des débris de cellules à l’aide d’un anticorps αNFAT2. Après purification, les fragments d’ADN associées sont détectés par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Des séquences d’ADN avec évident enrichissement représentent des régions du génome qui sont ciblées par les NFAT2 en vivo. Tonte appropriée de l’ADN et la sélection de l’anticorps requis sont particulièrement crucial pour l’application de cette méthode. Ce protocole est idéal pour la démonstration des interactions directes de NFAT2 avec des gènes cibles. Sa principale limitation est la difficulté d’employer la puce lors d’essais à grande échelle, analysant les gènes cibles de plusieurs facteurs de transcription dans les organismes intacts.
Introduction
Leucémie lymphoïde chronique (LLC) représente la leucémie plus courante chez les adultes dans les pays occidentaux, présentant une accumulation distincte de CD19, CD5 et CD23 exprimant B mature cellules1. La plupart des patients présentent une évolution de la maladie indolente, qui ne nécessite pas de traitement spécifique pendant de nombreuses années. En revanche, certains patients montrent une progression rapide nécessitant des interventions thérapeutiques immédiates avec immunitaire-chimiothérapie ou autres thérapies ciblées2,3. Facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) est une famille de facteurs de transcription contrôlant divers du développement et processus d’activation de nombreuses cellules types4,5,6. Nous avons démontré récemment surexpression et activation constitutionnelle de NFAT2 dans les cellules CLL de patients atteints de maladie indolente7. Ici, il règle un État ne répondant pas à la stimulation des récepteurs de cellules de B appelé anergie7. Pour démontrer que les NFAT2 se lie au promoteur lymphocytes spécifiques protéine tyrosine kinase (LCK) et régule l’expression LCK dans les cellules humaines du CLL, une analyse d’immunoprécipitation de la chromatine spécifiques (ChIP) a été développée et utilisée.
Puce est une des plusieurs techniques pour enquêter sur le rôle des facteurs de transcription à l’ expression de gène8. L’expression des gènes est bien orchestrée de façon très complexe par plusieurs organismes de réglementation présentant des facteurs de transcription, en tenant un rôle irremplaçable dans ce processus9,10,11,12. Facteurs de transcription régulant l’expression de gène dans un contexte spatial et temporel ont été identifiés chez de nombreuses espèces (par exemple, pour le développement et la différenciation)13,14,15, 16,17,18. Erreurs dans les mécanismes de contrôle complexes faisant intervenir des facteurs de transcription peuvent conduire à une variété de processus pathologiques, y compris le cancer19,20. Par conséquent, identification des facteurs de transcription et de leurs cibles respectives peut-être offrir nouvelles avenues thérapeutiques21,22. Afin d’étudier ce domaine fascinant, plusieurs méthodes sont disponibles comme puce, analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA), différents dosages d’ADN déroulants et journaliste-essais8,11,12, 23 , 24.
Pour démontrer qu’un certain facteur de transcription interagit avec certaines régions du génome, in vivo, ChIP est une technique idéale de25. À cet effet, ADN et protéines associées dans les cellules vivantes sont réticulées en utilisant l’irradiation UV ou formaldéhyde (puce réticulé, XChIP). Cette étape est omise pour obtenir le meilleur ADN et récupération de protéines dans la dite native de puce (NChIP)26. Par la suite, les complexes de protéines et l’ADN sont cisaillés par sonication en fragments d’environ 200 à 500 paires de bases (PB) et immunoprécipitée des débris cellulaires à l’aide d’un anticorps spécifique contre le facteur de transcription d’intérêt. Les fragments d’ADN associées sont ensuite purifiées et caractérisées par PCR, clonage et séquençage. Techniques alternatives utilisent des puces à ADN (ChIP-on-Chip) ou le séquençage de prochaine génération (ChIP-Seq) pour analyser l’ADN d’immunoprécipitée.
Puce a été introduite par Gilmour et Lis en 1984 quand ils ont utilisé des UV lumière de façon covalente de réticulation ADN et lié des protéines dans la vie des bactéries27. Lors de la lyse cellulaire et immunoprécipitation de la polymérase de l’ARN, des sondes spécifiques de gènes connus ont été utilisés pour cartographier la in vivo la distribution et la densité de l’ARN polymérase. La méthode a été par la suite utilisée par les mêmes chercheurs pour analyser la distribution des eucaryote ARN polymérase II sur les gènes de protéines de choc thermique dans la drosophile28. Le test de XChIP a été affiné par Varshavsky et collègues de travail qui a d’abord été utilisé formaldéhyde de réticulation pour étudier l’association de l’histone H4 avec heat shock protéines gènes29,30. L’approche NChIP, qui comporte l’avantage d’une meilleure récupération de l’ADN et des protéines en raison des épitopes naturellement intactes et, par conséquent, une plus grande spécificité de l’anticorps, a été décrite par Hebbes et collègues 198831.
L’avantage de la puce par rapport à d’autres techniques pour analyser les interactions ADN-protéines est en fait, que l’interaction réelle d’un facteur de transcription peut être étudié in vivo et aucune des sondes ou des conditions artificielles créées par des tampons ou des gels sont employait8,11,12. En combinant puce avec le séquençage de nouvelle génération, plusieurs cibles peuvent être identifiés en même temps.
Les principales limites de cette technique sont son applicabilité limitée aux essais à grande échelle dans les organismes intact25. L’analyse des modèles d’expression différentielle des gènes peut être aussi difficile à l’aide de techniques de puce si les protéines respectifs sont exprimés uniquement à des niveaux bas ou pendant les fenêtres de temps étroit. Un autre facteur potentiellement limitant est la disponibilité d’un anticorps approprié adapté pour puce11.
Le protocole de puce présenté ici peut être employé pour identifier des gènes de cible d’un facteur de transcription in vivo par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR). Plus précisément, l’objectif était d’identifier les gènes de la nouvelle cible de NFAT2 en CLL. Puce a été choisi en raison de son potentiel de démontrer directement la liaison de la NFAT2 pour les régions promotrices des gènes cibles différents dans des conditions naturelles dans des cellules humaines CLL patients.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes cruciales d’effectuer une analyse réussie de la puce sont la sélection d’un anticorps approprié et l’optimisation de la chromatine processus25de cisaillement. La sélection de l’anticorps αNFAT2 s’est avérée particulièrement difficile lors de l’élaboration du présent protocole. Bien qu’il existe plusieurs anticorps αNFAT2 disponibles dans le commerce et la majorité de ces oeuvres fines pour éponger occidental et d’autres applications, clone 7 a 6 a été le …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la DFG accorder MU 3340/1-1 et la Deutsche Krebshilfe accordent 111134 (tous deux attribués à M.R.M.). Nous remercions Elke Malenke excellente assistance technique).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
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