En Chromatin Immunoprecipitation analysen identifisere romanen NFAT2 målet gener i kronisk lymfatisk leukemi
Summary
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) er den vanligste leukemi i den vestlige verden. NFAT transkripsjonsfaktorer er viktig regulatorer og aktivisering i rekke celletyper. Her presenterer vi en protokoll for bruk av chromatin immunoprecipitation (ChIP) i CLL menneskeceller å identifisere romanen målet gener av NFAT2.
Abstract
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) er preget av utvidelse av ondartet B-cellen kloner og representerer den vanligste leukemi i vestlige land. Fleste CLL pasienter viser en lat Sykdomsforløp samt en anergic fenotypen av leukemi celler, henviser til en B-celle reseptor slutter å svare på ytre stimulering. Vi har nylig vist at transkripsjon faktoren NFAT2 er en viktig regulator av anergy i CLL. En stor utfordring i analysen av rollen som en transkripsjon faktor i ulike sykdommer er identifikasjonen av sin bestemt mål gener. Dette er av stor betydning for utviklingen av pathogenetic mekanismer og potensielle terapeutiske tiltak. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) er en klassisk teknikk å demonstrere protein-DNA interaksjoner og kan derfor brukes til å identifisere direkte mål gener av transkripsjonsfaktorer i pattedyrceller. Her, ble ChIP brukt til å identifisere LCK som en direkte mål genet av NFAT2 i menneskeceller CLL. DNA og tilhørende proteiner er krysskoblet med formaldehyd og senere skåret av sonication i DNA fragmenter av ca 200-500 base parene (bp). Krysskoblede DNA fragmenter forbundet med NFAT2 er så selektivt immunoprecipitated fra celle rusk å bruke et αNFAT2 antistoff. Etter rensing oppdages tilknyttede DNA fragmenter via kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR). DNA-sekvenser med tydelig berikelse representerer områder i genomet som er angitt av NFAT2 i vivo. Aktuelle klipping av DNA og valg av nødvendige antistoffer er spesielt viktig for bruk av denne metoden. Denne protokollen er ideell for demonstrasjon av direkte vekselsvirkningene av NFAT2 med mål gener. Dens stor begrensning er vanskeligheten å ansette ChIP i store analyser analysere målet genene for flere transkripsjonsfaktorer i intakt organismer.
Introduction
Kronisk lymfatisk leukemi (CLL) representerer de vanligste leukemi hos voksne i vestlige land, viser tydelig opphopning av CD19 og CD23 CD5 uttrykke modne B celler1. De fleste pasienter utstillingen en lat sykdom kurset, som ikke kreve spesifikk behandling i mange år. Derimot viser noen pasienter rask progresjon krever umiddelbar terapeutisk intervensjon med immun-kjemoterapi eller andre målrettet terapi2,3. Kjernefysiske faktor av aktivert T-celler (NFAT) er en familie av transkripsjonsfaktorer kontrollere ulike utviklingsmessige og aktivisering prosesser i mange celle typer4,5,6. Vi nylig viste overuttrykte og konstitusjonelle aktivering av NFAT2 i CLL celler fra pasienter med lat sykdom7. Her, regulerer den en unresponsive tilstand til B celle reseptor stimulering kalt anergy7. For å demonstrere at NFAT2 binder lymfocytt-spesifikke protein tyrosin kinase (LCK) selskapet og regulerer LCK uttrykk i menneskelige CLL celler, en bestemt chromatin immunoprecipitation analysen ble (ChIP) utviklet og ansatt.
Brikken er en av de flere teknikkene for å undersøke hvilken rolle transkripsjonsfaktorer i gene expression8. Genuttrykk er tett organisert på en svært komplisert måte av flere regulatorer med transkripsjonsfaktorer tar en uerstattelig del i denne prosessen9,10,11,12. Transkripsjonsfaktorer regulere genuttrykk i romlig og tidsmessige sammenheng er blitt identifisert i mange arter (f.eks for utvikling og differensiering)13,14,15, 16,17,18. Feil i intrikate kontrollmekanismer som involverer transkripsjonsfaktorer kan føre til en rekke patologisk prosesser inkludert kreft19,20. Identifikasjon av transkripsjonsfaktorer og deres respektive målene kan derfor tilby romanen terapeutiske veier21,22. For å undersøke dette spennende feltet finnes det flere metoder som ChIP, electrophoretic mobilitet Skift analysen (EMSA), ulike DNA rullegardinmenyen analyser og reporter-analyser8,11,12, 23 , 24.
For å demonstrere at en viss transkripsjon faktor samhandler med bestemte regioner i genomet er i vivo, . ChIP en ideell teknikk25. For dette formålet, er DNA og tilhørende proteiner i levende celler krysskoblet UV bestråling eller formaldehyd (krysskoblet ChIP, XChIP). Dette trinnet er utelatt å få bedre DNA og protein utvinning i den såkalte innfødte ChIP (NChIP)26. DNA-protein komplekser skråstilles senere av sonication i fragmenter av ca 200-500 base parene (bp) og immunoprecipitated fra celle rusk med et spesifikt antistoff mot transkripsjon faktoren av interesse. Tilknyttede DNA fragmenter er så renset og preget av PCR, molekylær kloning og sekvenser. Alternative teknikker bruke microarrays (ChIP-on-Chip) eller den neste generasjons sekvensering (ChIP-Seq) til å analysere immunoprecipitated DNA.
ChIP ble først introdusert av Gilmour og Lis i 1984 når de brukte UV lys til covalently krysskobling DNA og bundet proteiner i levende bakterier27. Cellen lyse og immunoprecipitation av bakteriell RNA polymerase, ble bestemte sonder av kjente gener brukt til kart i vivo distribusjon og tetthet av RNA polymerase. Metoden ble senere brukt av samme etterforskerne for å analysere fordelingen av eukaryote RNA polymerase II på varme sjokk protein gener i Drosophila28. XChIP analysen var fremme raffinert av Varshavsky og kolleger som først brukte formaldehyd cross-linking for å studere tilknytningen av histone H4 varme sjokk protein gener29,30. NChIP tilnærming, som bærer fordelen av en bedre DNA og protein utvinning på grunn av naturlig intakt epitoper og, derfor større antistoff spesifisitet, ble først beskrevet av Hebbes og kolleger i 198831.
Fordelen med ChIP i forhold til andre teknikker for å analysere DNA-protein interaksjoner er faktisk at faktiske samspillet av en transkripsjon faktor kan være undersøkt i vivo og ingen sonder eller kunstig betingelser som buffere eller gels ansatt8,11,12. Ved å kombinere ChIP med neste generasjons sekvensering, kan flere mål identifiseres samtidig.
Store begrensninger av denne teknikken er den begrenset bruksområde omfattende analyser i intakt organismer25. Analyse av differensial genet uttrykk mønstre kan også være utfordrende med ChIP teknikker hvis respektive proteiner uttrykkes bare i lave nivåer eller under smale tidsvinduer. En annen potensielt begrensende faktor er tilgjengeligheten av et passende antistoff egnet for ChIP11.
ChIP protokollen presenteres her kan være ansatt i vivo identifikasjonen av målet gener av en transkripsjon faktor av kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR). Spesielt var målet å identifisere romanen målet gener av NFAT2 i CLL. ChIP ble valgt fordi dens potensiale direkte demonstrere binding av NFAT2 til regionene arrangøren av ulike gener under naturlige forhold i CLL pasienten menneskeceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viktige skritt for å utføre en vellykket ChIP-analysen er utvalget av et passende antistoff og optimalisering av chromatin klippe prosessen25. Valg av αNFAT2 antistoffer viste seg for å være spesielt utfordrende under utviklingen av denne protokollen. Det finnes flere αNFAT2 antistoffer kommersielt tilgjengelig og fleste av disse arbeider fin for vestlige blotting og andre programmer, var klone 7A6 bare antistoffer som kan brukes med hell for ChIP7. Selv tilsynelatend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av DFG gi MU 3340/1-1 og Deutsche Krebshilfe gi 111134 (både til M.R.M.). Vi takker Elke Malenke for utmerket kundestøtte).
Materials
| 1 X PBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 1.5 mL tube shaker Themomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Can be substituted with similar instruments |
| 10X Bolt Sample Reducing Agent | Thermo Scientific | B0009 | |
| 20X Bolt MES SDS Running Buffer | Thermo Scientific | B0002 | |
| 37 % Formaldehyde p.a., ACS | Roth | 4979.1 | |
| 4X Bolt LDS Sample Buffer | Thermo Scientific | B0007 | |
| Anti-NFAT2 antibody | Alexis | 1008505 | Clone 7A6 |
| Anti-NFAT2 antibody | Cell Signaling | 8032S | Clone D15F1 |
| Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade | Abcam | ab2796 | Clone 7A6 |
| big Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Can be substituted with similar instruments |
| CD19-FITC mouse Anti-human | BD Biosciences | 555412 | Clone HIB19 |
| CD5-PE mouse Anti-human CD5 | BD Biosciences | 555353 | Clone UCHT2 |
| Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) | Merck | L 6115 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | eppendorf | 22431021 | |
| FBS superior | Merck | S0615 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | Can be substituted with similar instruments |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | Thermo Scientific | IB21001 | |
| iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size | Thermo Scientific | IB23001 | |
| iDeal ChIp-seq kit for Histones | Diagenode | C01010059 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma Aldrich | I3909 | |
| IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | LI-COR Biosciences | 926-68023 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg | LI-COR Biosciences | 925-32210 | |
| LI-COR Odyssey Infrared Imaging System | LI-COR Biosciences | B446 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche | 4729692001 | Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments |
| Lysing Solution OptiLyse B | Beckman Coulter | IM1400 | |
| M220 AFA-grade water | Covaris | 520101 | |
| M220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500295 | |
| Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet | Thermo Scientific | 12301D | Can be substituted with similar instruments |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Thermo Scientific | 11140050 | |
| Microscope Axiovert 25 | Zeiss | 451200 | Can be substituted with similar instruments |
| microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm | Covaris | 520045 | |
| Neubauer improved counting chamber | Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442012 | Can be substituted with similar instruments |
| NH4 Heparin Monovette | Sarstedt | 02.1064 | |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | Thermo Scientific | NP0323BOX | |
| Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL | LI-COR Biosciences | 927-50000 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X | Merck | A2213 | |
| PerfeCTa SYBR Green FastMix | Quanta Bio | 95072-012 | |
| PMA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Primer CD40L promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’ | |
| Primer CD40L promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’ | |
| Primer IL-2 promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’ | |
| Primer IL-2 promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’ | |
| Primer LCK promotor region forward | Sigma Aldrich | 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’ | |
| Primer LCK promotor region reverse | Sigma Aldrich | 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’ | |
| Rabbit mAb IgG XP Isotype Control | Cell Signaling | # 3900S | Clone DA1E |
| Real-time PCR instrument | Roche | LightCycler 480 | Can be substituted with similar instruments |
| Roller mixers | Phoenix Instrument | RS-TR 5 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Scientific | 61870010 | |
| Safety-Multifly-needle 21G | Sarstedt | 851638235 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | |
| Shaker Duomax 1030 | Heidolph Instruments | 543-32205-00 | Can be substituted with similar instruments |
| small Centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Fresco 17 | Can be substituted with similar instruments |
| Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | |
| ß-Mercaptoethanol | Thermo Scientific | 21985023 | |
| Tris Buffered Saline (TBS-10X) | Cell Signaling | #12498 | |
| Trypan Blue solution | Sigma Aldrich | 93595-50ML |
References
- Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
- Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
- Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
- Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
- Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
- Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
- Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
- Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
- Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
- Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
- Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
- Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
- Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
- Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
- Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
- Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
- Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
- Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
- Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
- Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
- Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
- Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
- Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
- Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
- Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
- Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
- Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
- Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
- Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
- Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).
