Elastisk farging på parafin-embedded lysbilder av pT3N0M0 magekreft vev

Summary

Her presenterer vi en protokoll av elastiske flekker å identifisere elastiske fibre i pT3N0M0 magekreft vev på formalin-faste, parafin-embedded seksjoner. Deretter beskriver vi en metode for å fastslå om tumorceller invadere utover elastisk lamina.

Abstract

Den elastiske lamina, som vanligvis er plassert i det sub-Mesothelial laget, ved siden av peritoneum mesothelial celler, er amfifile på hematoksylin og eosin (H & E) farging, men kan bli visualisere gjennom elastisk farging. En av de viktigste fordelene med elastisk farging er at det gjør det enkelt å fastslå om tumorceller har invadert utover elastisk lamina. Dette bidrar til å undersøke omfanget av bukhulen overflate invasjon, og dermed skille pT3 og pT4 stadier i Gastrointestinal kreft. I denne studien presenterer vi en protokoll for å identifisere elastiske fibre i formalin-faste, parafin-embedded pT3N0M0 magekreft vev seksjoner. Vi klargjør 5 μm parafin seksjoner fast på lysbilder, og deretter alle lysbildene er deparaffinated og rehydrert under farging prosedyren. Deretter er alle seksjonene oksidert av kalium kaliumpermanganat, bleket av oksalsyre syre, beiset av elastiske flekker, og counterstained av van Gieson ‘ s. Til slutt undersøker vi effekten av farging; elastisk lamina er beiset blå-svart og kollagen fibre er farget rødt, mens kreftcellene er beiset i varierende nyanser av gult. I detalj beskriver vi også metodene som brukes for å bestemme posisjons Forholdet mellom kreftceller og elastiske lamina. Denne metoden er enkel, lav pris, og mye som gjelder i identifisering av bukhulen overflate invasjon i Gastrointestinal kreft på grunn av sin fremragende selektivitet for elastiske fibre og autentiske resultater.

Introduction

I henhold til tumor, node, og metastasering (TNM) kreft staging system, prognosen for magekreft ved patologisk stadium pT4 er betydelig verre enn at pT3 (8th UICC/AJCC)¹. Med magekreft, klassifisering av den primære tumor (pT) vanligvis avhenger av dybden av tumor invasjon². Patologisk scenen pT3 magekreft er definert som kreft invadere gjennom muscularis propria i subserosal vev, mens pT4 magekreft er definert som kreft trengende til overflaten av visceral peritoneum. Tilstedeværelsen av bukhulen overflaten invasiveness er nøkkelen til å skille de to stadiene². Men fordi den bukhulen mesothelial celle laget er svært tynn, kan det bli skadet under operasjonen, postoperativ behandling, og fiksering³. Videre tumor-relaterte inflammatoriske forandringer og fibrose kan skade den normale anatomi av peritoneum, som gjør det svært vanskelig å nøyaktig bedømme den bukhulen overflaten invasjon med bare H & E farging⁴. Gjeldende metoder for hjelpe diagnostisering, for eksempel Cytologi og immunhistokjemi, er av begrenset diagnostisk verdi på^5,6 fordi de er falske positive eller har lavkostnads effektivitet.

Serosal membranen inkluderer peritoneum, pleura og pericardium, og er sammensatt av mesothelium, en kjeller membran, og et sub-mesothelial lag⁷. En vanlig histologiske funksjon i serosal membranen er tilstedeværelsen av en elastisk lamina i sub-mesothelial lag, ved siden av mesothelial cellene^8,9. Elastisk lamina har en sterk anti-ødeleggende evne og kan tjene som en alternativ Prognostisk markør hvis mesothelial celler er ødelagt av alvorlig tumor-relaterte betennelser eller fibrose³. Elastisk lamina består hovedsakelig av elastin og microfibril¹⁰, som kan bli sett av elastiske flekker. Den viktigste årsaken bak bruken av elastisk farging er at elastin danner et hydrogen bånd med fenoliske gruppe resorcinol i elastin løsning, forårsaker elastisk fiber skal beiset blå-svart. Etter van Gieson (VG) kontrasterende flekker, kan kollagen fibre være farget rød og muskelfibre og røde blodlegemer kan være farget gul⁸,^11,12,13.

Den åttende utgaven av TNM oppsetning av lungekreft definerer visceral pleural invasjon (T2) som en svulst invasjon utover elastisk lamina eller en invasjon på overflaten av visceral pleura². Studier på tykktarmskreft har vist at elastisk lamina invasjon i pT3 tykktarmskreft kan være årsaken til dårlig prognoser. Den 5 år sykdom-fri og generell overlevelse av tykktarmskreft har også vist seg å være som pT4a^13,14,15. Basert på våre tidligere studier på elastiske flekker, har elastisk lamina invasjon blitt funnet å ha en betydelig negativ innflytelse på prognosen for pT3 magekreft og bør behandles på samme måte som pT4a magekreft¹². Derfor kan denne enkle og kostnadseffektive metoden bidra til å eliminere usikkerhet i resultatene som oppnås gjennom H & E farging, og andre vanlige begrensninger knyttet til andre metoder for hjelpe diagnostisering, inkludert Cytologi og immunhistokjemi, blant Andre. Denne metoden kan brukes effektivt til å diagnostisere overflate invasjoner av magekreft, spesielt i noen tvetydige tilfeller. Det er praktisk siden H & E flekk og andre flekker vanligvis gjør det vanskelig å identifisere slike invasjoner. Denne metoden sikrer også en pålitelighet av resultater siden det er svært selektiv, spesielt til elastiske fibre. Her gjennomfører vi elastiske flekker for å avgjøre om tumorceller har invadert den elastiske lamina i pT3N0M0 magekreft¹².

Denne metoden brukes for å identifisere elastiske fibre i vev på formalin-faste, parafin-embedded seksjoner, og kan brukes til frosne seksjoner også. Her velger vi parafin-embedded seksjoner for best vedlikehold av cellulære og vev morfologi. Alle trinnene i denne protokollen finner sted ved romtemperatur. En reklamen flekk utstyr hvilke inkluderer en kalium kaliumpermanganat løsning, en oksalsyre syren løsning, en elastin løsning, og en Van Gieson ‘ løsning er anvendt inne det forevist studere.

Protocol

Mellom 1994 og 2005 ble pasientprøvene utvalgt av to erfarne gastrointestinale patologer i det tilknyttede Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, fra pasienter som LED gastrektomi av mage svulster, med en postoperativ patologisk diagnose av magekreft på pT3N0M0 scenen (i henhold til den syvende TNM staging). Denne studien ble godkjent av etikk Review Committee. 1. snitting Plasser para fin blokken i en fast holder på sleden mikrotomen, som kan bev…

Representative Results

En vellykket elastisk flekker avslører tydelig elastisk lamina og kreftceller i pT3 magekreft. Figur 1 -lav effektfeltet, mikroskopisk sjekket etter elastin løsning flekker, før van Gieson ‘ s counterstain som per protokollen nevnt-viser elastisk lamina er nær den serosal mesothelial celler og er farget blå-svart i form av filamenter, og det er fortsatt en viss avstand mellom tumorceller og elastisk lamina. Figur 2 er en typ…

Discussion

Denne metoden foreslås her gir en nøyaktig tilnærming for å identifisere subserosal elastisk lamina. Metoden kan brukes til å evaluere om tumorceller har invadert den elastiske lamina i pT3N0M0 magekreft¹². Elastisk lamina er rødlig i H & E-beiset seksjoner, som ikke kunne lett skilles fra kollagen fibre, og andre eksisterende ekstra diagnose metoder, for eksempel Cytologi og immunhistokjemi, også utøvde begrenset diagnostisk verdi. Funn av tumorceller i bukhulen vanner væsken ikke nødve…

Materials

Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585