Elastisk färgning på paraffin-inbäddade diabilder av pT3N0M0 mag cancer vävnad
Summary
Här presenterar vi ett protokoll av elastisk färgning för att identifiera elastiska fibrer i pT3N0M0 magcancer vävnader på formalin-fast, paraffin-inbäddade sektioner. Därefter beskriver vi en metod för att avgöra om tumörceller invaderar bortom den elastiska lamina.
Abstract
Den elastiska lamina, som vanligtvis ligger i sub-mesothelial skikt, intill bukhinnan mesothelial celler, är amfifila på hematoxylin och eosin (H & E) färgning men kan visualiseras genom elastisk färgning. En av de viktiga fördelarna med elastisk färgning är att det gör det enkelt att avgöra om tumörceller har invaderat bortom den elastiska lamina. Detta hjälper till att undersöka omfattningen av peritonealdialys yta invasion, därigenom skilja pT3 och pT4 stadier i mag-tarmcancer. I denna studie presenterar vi ett protokoll för att identifiera elastiska fibrer i formalin-fast, paraffin-inbäddade pT3N0M0 magcancer vävnad sektioner. Vi förbereder 5-μm paraffin avsnitt fast på diabilder, och sedan alla bilder är avparaffinerade och rehydreras under färgning förfarande. Därefter, alla sektioner oxideras av kaliumpermanganat, blekt av oxalsyra, färgade av elastisk färgning, och motmålat av van Gieson ‘ s. Slutligen undersöker vi effekten av färgning; elastisk lamina är målat blå-svart och kollagenfibrer är färgade röda, medan cancerceller är färgade i varierande nyanser av gult. Vi beskriver också i detalj de metoder som används för att bestämma positionella förhållandet mellan cancerceller och elastisk lamina. Denna metod är enkel, låg kostnad, och allmänt tillämplig i identifieringen av peritonealdialys yta invasion i mag-tarmcancer på grund av dess enastående selektivitet för elastiska fibrer och autentiska resultat.
Introduction
Enligt tumören, Node, och metastaser (TNM) cancer Staging system, prognosen för magsäckscancer vid patologiska skede pT4 är betydligt värre än på pT3 (8: e UICC/AJCC)1. Med ventrikelcancer, klassificering av den primära tumören (pT) beror oftast på djupet av tumörinvasion2. Pathologic Stage pT3 ventrikelcancer definieras som cancer invaderar genom muscularis hinna propria i subserosal vävnader, medan pT4 ventrikelcancer definieras som cancer tränger in på ytan av visceral peritoneum. Närvaron av peritonealdialys yta invasivitet är nyckeln för att skilja de två stadierna2. Emellertid, eftersom peritonealdialys mesothelial cell skiktet är mycket tunn, det kan skadas under operationen, postoperativ behandling, och fixering3. Dessutom kan tumörrelaterade inflammatoriska förändringar och fibros skada den normala anatomin i peritoneum, vilket gör det mycket svårt att korrekt bedöma peritonealdialys yta invasion med endast H & E färgning4. Nuvarande hjälp diagnosmetoder såsom cytologi och immunohistokemi är av begränsat diagnostiskt värde5,6 eftersom de är falskt positiva eller har en lågkostnads effektivitet.
Den serosal membran inkluderar peritoneum, pleura, och hjärtsäcken, och består av mesothelium, en basalmembran, och en sub-mesothelial Layer7. En vanlig histologisk egenskap hos serosal membranet är närvaron av en elastisk lamina i sub-mesothelial skikt, intill mesothelial celler8,9. Elastisk lamina har en stark anti-skadande förmåga och kan fungera som en alternativ prognostisk markör om mesothelial celler förstörs av svår tumörrelaterad inflammation eller fibros3. Elastisk lamina består huvudsakligen av elastin och microfibril10, som kan visualiseras genom elastisk färgning. Den främsta orsaken bakom användningen av den elastiska färgning är att elastin bildar en vätebindning med fenoliska gruppen av resorcinol i elastin lösning, vilket gör att elastiska fibrer ska färgas blå-svart. Efter van Gieson (VG) kontrasterande färgning, kollagenfibrer kan färgas röda och muskelfibrer och röda blodkroppar kan färgas gul8,11,12,13.
Den åttonde upplagan av TNM iscensättningen av lungcancer definierar visceral pleurautgjutning invasion (T2) som en tumörinvasion bortom elastisk lamina eller en invasion på ytan av visceral lungsäcken2. Studier på kolorektal cancer har visat att den elastiska lamina invasionen i pT3 kolorektal cancer kan vara orsaken till dåliga prognoser. Den 5-åriga sjukdomsfria och totala överlevnaden av kolorektal cancer har också visat sig vara som pT4a13,14,15. Baserat på våra tidigare studier om elastisk färgning, elastisk lamina invasion har visat sig ha en betydande negativ inverkan på prognosen för pT3 ventrikelcancer och bör behandlas på samma sätt som pT4a ventrikelcancer12. Därför kan denna enkla och kostnadseffektiva metod bidra till att eliminera osäkerhet i resultat som erhållits genom H & E färgning, och andra gemensamma begränsningar i samband med andra hjälp diagnosmetoder, inklusive cytologi och immunohistokemi, bland Andra. Denna metod kan användas effektivt för att diagnostisera peritonealdialys yta invasioner av mag-tarmcancer, särskilt i vissa tvetydiga fall. Det är bekvämt eftersom H & E fläcken och andra fläckar brukar göra det svårt att identifiera sådana invasioner. Denna metod garanterar också en tillförlitlighet av resultat eftersom det är mycket selektiv, särskilt till elastiska fibrer. Här, vi utför elastisk färgning för att avgöra om tumörceller har invaderat den elastiska lamina i pT3N0M0 ventrikelcancer12.
Denna metod används för att identifiera elastiska fibrer i vävnader på formalin-fast, paraffin-inbäddade sektioner, och kan användas för frysta sektioner också. Här väljer vi paraffin-inbäddade sektioner för bästa underhåll av cellulära och vävnadens morfologi. Alla steg i detta protokoll sker i rumstemperatur. En kommersiell infärgning kit som innehåller en kaliumpermanganat lösning, en oxalsyra lösning, en elastin lösning, och en van Gieson lösning används i den presenterade studien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod som föreslås här ger en korrekt metod för att identifiera subserosal elastisk lamina. Metoden kan användas för att utvärdera om tumörceller har invaderat den elastiska lamina i pT3N0M0 ventrikelcancer12. Elastisk lamina är rödaktig i H & E-färgade sektioner, som inte kunde lätt skiljas från kollagenfibrer, och andra befintliga hjälp diagnosmetoder, såsom cytologi och immunohistokemi, också utövade begränsat diagnostiskt värde. Konstaterandet av tumörceller i periton…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar stödet delvis från National Natural Science Foundation (nr 81401902 och NO. 81501992) och Hunan Natural Science Foundation (nr 2017SK2134, Nr. 2018JJ2238). Manuskriptet är skriven av Guang Lei. Hela experimentet utförs av Guang lei och Haiyan Yang. Författarna tackar hjälp av patologer och stipendiater som följer upp patienternas data.
Materials
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N., Mills, S. E. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. , 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin–a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert’s resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
