Summary
여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.
Abstract
결핵균 은 현재 매년 1.7 백만 사망자와 10.4 백만 감염을 일으키는 최악의 인간 병원 체입니다. 이 박테리아에 노출 인간 멸 균된 감염에서 적극적으로 진행 하는 치명적인 질환에 이르기까지 다양 한 질병 스펙트럼을 발생 합니다. 가장 일반적인 형식은 잠재성 결핵, 무 증상, 하지만 가능성이 fulminant 질병으로 다시 활성화 합니다. 성인 제 브라와 그것의 자연 병원 체 진 균 marinum 최근 결핵의 질병 넓은 스펙트럼을 공부 하는 해당 모델을 입증 했다. 중요 한 것은, mycobacterial 감염의 맥락에서 적응 면역 반응 뿐만 아니라 자발적인 대기 시간 및 재가이 모델에서 공부 될 수 있다. 이 문서에서는, 우리는 성인 zebrafish, mycobacterial 로드 및 양이 많은 PCR에 의해 호스트 면역 응답의 측정에 대 한 핵 산 추출에 대 한 내부 장기의 컬렉션의 실험적인 감염에 대 한 방법을 설명합니다. -집을-개발한, M. marinum-특정 정량 분석 결과 또한 비 분할 휴면 또는 최근에 죽은 mycobacteria에서 DNA 탐지 전통적인 도금 방법 보다 더 민감한. 로 동일한 개인에서 DNA와 RNA 추출, 질병 상태, 그리고 호스트와 병원 체 유전자 발현의 관계를 연구 가능 하다. 결핵에 대 한 성인 zebrafish 모델은 따라서 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 매우 적용, 비 포유류에서 vivo에서 시스템으로 자체을 선물 한다.
Introduction
Zebrafish (Danio rerio) 생물 의학 연구에 널리 사용 되는 동물 모델 이며 일반적인 척 추가 있는 생물학에 대 한 허용된 모델입니다. Zebrafish는 인간의 질병을 모델링 연구의 많은 분야에 맞게 조정 되었습니다 및 감염 및 면역학 연구의 여러 세균 3 및 바이러스 감염4 1 암 심장 질환2 에서 장애 , 5. 또한, zebrafish 태아의 전 utero 개발 했다는 제 브라 인기 모델 개발 생물학6 및 독물학7,8.
감염 생물학을 포함 하 여, 연구의 많은 분야에서 광학 투명 zebrafish 애벌레는 일반적으로 사용 됩니다. 원시 세포는 검색 된9때 첫 번째 면역 세포 24 h 게시물 수정 (hpf)에 표시 됩니다. 호 중구는 약 33 hpf10표시 다음 면역 세포 이다. Zebrafish 애벌레는 이렇게 감염의 초기 단계 적응 면역 세포11의 부재에서 타고 난 면제의 역할을 연구 하 고 실현. 그러나, 그것의 완전 한 기능 적응 면역 시스템과 성인 zebrafish 감염 실험에 대 한 복잡성의 추가 계층을 제공합니다. T 세포 감지할 수 있습니다 주위 3 일 게시물 수정12및 B 세포는 기능 항 체를 생산할 수 4 주 게시물 수정13. 성인 zebrafish 포유류 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 모든 주요 대응 하고있다. 물고기의 immune systems와 인간 사이의 주요 차이점은 림프 조직의 해부학에서 뿐만 아니라 항 체 isotypes에서 발견 된다. Zebrafish는 반해 인간이 515세 항 체 클래스14, 있다. 골 수와 림프절의 부재, 물고기에서 기본 림프 장기는 신장과 thymus16 와 비장, 신장과 창 자 2 차 림프 기관17역할. 타고 난 및 적응형 셀의 전체 면역 무기고와 이러한 차이도 불구 하 고 성인 zebrafish 호스트 병원 체 상호 작용 연구에 대 한 높은 적용, 사용 하기 쉬운, 비 포유류 모델입니다.
Zebrafish는 요즘 결핵18,,1920,,2122공부 가능한 모델로 설립 되었습니다. 결핵은 결핵균에 의해 발생 하는 공 수 질병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 결핵 2016 년에1.7 백만 죽음을 야기 하 고 하나의 병원 체 전세계23에 의해 죽음의 주요 원인이 다. 마우스24,25, 토끼26 및 비 인간 영장류27 가장 유명한 동물 모델 각 얼굴 하지만 결핵 연구에 그들의 한계는. M. 결핵 감염의 비 인간 영장류 모델 유사 인간의 질병 가장 밀접 하 게, 하지만이 모델을 사용 하 여 하는 것은 심각한 윤리적 고려 사항으로 인해 제한 합니다. 다른 동물 모델 M. 결핵 질병 병 리에 영향을 주는 호스트 특이성에 의해 방해 된다. 아마 결핵 모델링에서 가장 큰 문제는 인간의 질병에 감염 및 질병 결과의 광범위 한 스펙트럼: 결핵은 매우 이질적인 질병 면역 잠재성, 활성 및 다시 활성화 감염28 살 균에서 배열 을 재현 하 고 실험적으로 모델 하기 어려울 수 있습니다.
진 균 marinum 85% 아미노산 신원을29와 ~ 3000 orthologous 단백질 M. 결핵 의 가까운 친척 이다. M. marinum 는 자연스럽 게 zebrafish 생산 육아, 그것의 내부 장기19,30에서 결핵의 감염. 결핵 연구에 사용 되는 다른 동물 모델, 달리 zebrafish 생산 많은 자손, 그것은 제한 된 공간을 요구 한다 그리고 중요 한 것은, 그것은 neurophysiologically 최소한 개발된 척추 결핵 모델 사용할 수 있습니다. 또한, M. marinum 감염 원인 잠재성 감염, 활성 질병 이나 심지어 살 균 mycobacterial 감염의 성인 zebrafish 밀접 하 게 인간의 결핵19, 의 결과의 스펙트럼을 흉내 낸 31 , 32. 여기, M. marinum 복 부 캐비티에 주입 하 고 양이 많은 PCR를 사용 하 여 mycobacterial 부하와 제 브라에서 면역 반응을 측정 하 여 실험 결핵 모델 성인 zebrafish의 방법 설명 조직 샘플입니다.
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Protocol
모든 zebrafish 실험 동물 실험 보드 핀란드 (ESAVI/8245/04.10.07/2015)에 의해 승인 되었습니다가지고. 메서드는 법 (497/2013)와 핀란드에서 과학 또는 교육 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 정부 법령 (564/2013)에 따라 수행 됩니다.
1. 배양 진 균 marinum 의
참고: 진 균 marinum 능력이 인 간에 있는 표면 감염을 일으키는 병원 체 이기 때문에, 개인 안전 및이 박테리아와 함께 작업을 시작 하기 전에 생물 학적 폐기물 처리에 대 한 지역 가이드라인을 찾을.
- 문화 M. marinum 7 H 10에 적어도 5 일 동안 OADC (올레산, 알 부 민, 포도 당, 카 탈 라 제) 농축 및 0.5 %v / v 29 ° C에 글리세롤의 10% 보충 판. 매 2 주 냉장고에서 신선한 박테리아를 복용 하 고 매주 마다 새로운 접시에 전송 하 여 M. marinum 문화를 유지 합니다.
참고: M. marinum 자연 물고기 병원 체 감염 수생 종 이며 하지 zebrafish 주식 박테리아와 오염에 주의 하는 것이 중요 하다. 세균으로 오염 하는 항목과 감염 된 zebrafish 사육 시설에 별도로 보관 해야 합니다. - 살 균 1 µ L 접종 루프를 사용 하 여 aseptically 7 H 9의 10 mL를 포함 하는 셀 문화 플라스 크에 M. marinum 세균성 질량의 loopful 전송 보통 0.2 %v / v 폴 80 및 0.2 %v / v의 10% (알 부 민, 포도 당, 카 탈 라 제) ADC 농축으로 글리세롤입니다. 3-4 일 약 한 세600 (광학 밀도) 0.7 동요 없이 어둠 속에서 29 ° C에서의 문화. 모자, 떠나거나 필터 캡을 사용 하 여 가스의 충분 한 교류에 대 한 허용.
참고: 폴 80 박테리아의 집계를 방지 하기 위해 중간에 추가 됩니다. 또한, 빛에 노출 (예를 들어, 노란색 흰색에서 컬러 변경) 세균성 식민지에서 phenotypic 변화 이끌어 낸다. 이 방지 하려면 어둠 속에서 문화를 유지. - 분 광 광도 계와 OD600값을 측정 합니다. 0.07-0.09의 OD600 액체 문화를 희석 하 고 동요 없이 어둠 속에서 29 ° C에서 2 일 동안 배양을 계속 합니다. 느슨한 모자를 남겨 주세요.
참고: 두 일 동안 세균 현 탁 액 약 0.5에 해당 하는 초기 로그 단계의 OD600를 도달 한다.
2. 성인 Zebrafish 감염에 대 한 세균 솔루션의 준비
- 큰 살 균 베트 또는 15 mL 튜브에 세균 현 탁 액을 전송 및 정착에 큰 풀 수 있도록 15 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 그것을 배치.
- 깨끗 한 튜브 또는 베트에 현 탁 액의 최고 5 ~ 7 mL를 전송 하 고 OD600을 측정 한다. 정지이 최상위 단계를 사용 하 여 감염에 대 한.
- 신선한 튜브와 10000 x g에서 3 분 동안 원심 분리기로 M. marinum 문화의 1 mL를 수집 합니다. 상쾌한을 제거 하 고 살 균 1 x PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 희석 균 1을 사용 하 여 원하는 세균 농도 도달 하는 추적 프로그램으로 0.3 mg/mL 페 놀 레드 PBS x. 3 개의 aliquots로 희석된 정지를 나눕니다.
참고: 사용 하 여 미리 결정 된 OD600 CFU (콜로 니 형성 단위) 대 / µ L 곡선 추정 희석 하 5 µ L 주입 볼륨34에 박테리아의 원하는 숫자를 얻을 하는 데 필요한. OD600 와 세균 현 탁 액의 농도 사이의 상관 관계 실제 감염 실험을 시작 하기 전에 유효성을 검사 해야 합니다. 이 유효성 검사 데이터를 수집 하기 위해 2 주를 보유 합니다. - 1 mL 주사기를 사용 하 여, 천천히 풀 서 스 펜 션 27 G 통해 바늘 3 배. 각 약 수에 대 한 그냥 사용 하기 전에이 단계를 수행 합니다.
참고: 이상의 2 시간에 대 한 동일한 세균 솔루션을 사용 하지 마십시오.
3. 실험 복 주사로 M. marinum 감염
- 플라스틱 parafilm 영화의 조각에 희석된 세균 솔루션의 5 µ L 방울 고 30 G 인슐린 바늘에는 방울을 당겨.
- 5-8 달 사용-오래 된 야생 형 물고기와 실험에 대 한 rag1−/−hu1999 돌연변이 물고기. 0.02 %3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (pH 7.0) 탱크 물에 성인 제 브라 anesthetize 습 한 발포에 슬릿으로 물고기의 복 부 측을을 놓습니다.
참고: 걸 레-/- 돌연변이 물고기는 기능 T와 B 세포를 생산 하 고 체세포 재조합을 받을 수 없습니다. - 주사 바늘에 골반 지 느 러 미 사이 약 45 ° 각도. 전체 오프닝 복 부 캐비티 내부 관찰을 위쪽으로 바늘 개방 유지. 세균 현 탁 액을 천천히 주입 하 고 조심 스럽게 바늘을 제거 합니다.
참고: 경우 주입 시 물고기에서 누수 되는 빨간 추적 프로그램, 실험에서 생선을 제외 합니다. - 주입 후 즉시 신선한 탱크 물으로 복구 탱크에 물고기를 전송 합니다.
- 받아 샘플 7 H 10에 세균 현 탁 액의 플레이트 사용에서 aliquot 박테리아에서 매 15 분 및 5 일 29 ° C에서 박테리아를 품 어 고 접시에 식민지를 계산 하 여 감염 복용량을 확인 합니다.
- 물고기의 복지를 정기적으로 확인 하 고 0.02% 이상 감염의 증상이 있는 모든 물고기를 안락사 3 aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (pH 7.0)의 농도.
참고: 약, 성인 zebrafish의 7%에 감염 된 34 ± 15 CFU 709 CFU 2029 ±로 감염 된 zebrafish의 30% 및 8 주19증상을 했다 됩니다. 증상은 비정상적인 수영, 터치, 헐 떡이 고, 부 종 또는 낭비 하는 관찰의 부족을 포함할 수 있습니다. - 일반적인 표준35에 따르면 zebrafish를 유지 합니다.
4입니다. 내부 장기의 수집
- 3-aminobenzoic 산 에틸 에스테 르 (이상 0.02% 농도, pH 7.0) 탱크 물에서의 과다와 zebrafish 안락사
- 하나의 핀 branchiostegal 광선 및 꼬리 압정 플랫폼에 물고기를 통해 다른 후부를 삽입 합니다.
- 메스와 함께 전체 복 부 구멍을 열고 작은 숟가락과 날카로운 종단 핀셋을 사용 하 여 내부 장기를 수집 합니다. 마음에서 시작 하 고 분리 한 블록에 모든 내부 장기를 꼬리 쪽으로 척추를 따라 작동.
참고: 모든 신장 조직 숟가락으로 척추를 따라 된다고 하 여 수집 해야 합니다. - 마지막으로, 족집게를 사용 하 여 분리 하는 cloaca 옆 창 고 6 2.8 m m 세라믹 구슬 1.5 mL 균질 튜브로 기관 전송. 즉시 샘플을 동결 드라이 아이스에 놓습니다. -80 ° C까지 무 균에서 샘플을 저장할 수 있습니다.
- 개인 간의 70% 에탄올으로 악기를 씻어.
5. 균질 및 RNA 추출 기관 블록에서.
참고: 메서드는 스탠포드 대학 프로토콜36에서 수정 됩니다.
- 1500 µ L. 총 볼륨 샘플 상단 guanidine 안산-페 놀 솔루션 핵 산 추출 (자료 테이블)에 대 한 사용을 추가 샘플 총 볼륨의 10%의 최대를 커버 하는 확인 하십시오.
주의: 수확 조직의 예상된 볼륨은 100 µ L. Guanidine 안산-페 놀 솔루션에 포함 된 독성과 자극 화합물 하며 보호 의류, 니트 릴 장갑, 증기 두건에서 일. 이 독성 가스의 형성 원인이 됩니다 표 백제와 결합 하지 마십시오. 사용 하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽으십시오. - 40 3 번 구슬을 얻어 균질 화기를 사용 하 여 샘플을 균질 3200 rpm에서 s. 30 대 한 얼음에 멋진 사이클 사이 s. 9 분 물 욕조에 무 균된 샘플 sonicate
- 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g 에서 샘플 원심 고 신선한 microcentrifuge 관으로 지운된 homogenate의 1000 µ L를 이동 합니다.
- 클로 프롬의 200 µ L을 추가, 15에 대 한 vortexing에 의해 즉시 혼합 s와 실 온에서 2 분 동안 품 어.
주의: 클로 프롬은 유독 고 복합 자극, 흡입 하는 경우 삼 또는 피부 또는 눈 접촉. 개인 보호를 위해 필요한 안전 장비를 사용 하 고 증기 두건에서 작동. 사용 하기 전에 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 읽으십시오. - 수성 및 유기 단계를 구분을 4 ° C에서 15 분 동안 12000 x g 에서 원심.
- 신중 하 게, RNA 오염 방지 하려면 신선한 튜브에 500 µ L의 최고 단계를 전송 합니다. 제거 하 고 수성 단계 (~ 100 µ L)의 나머지를 버리고 interphase 및 DNA 추출에 대 한 유기 단계 4 ° C에서 저장.
참고: 상위 단계는 RNA를 포함합니다. - 2-프로 판 올의 500 µ L을 추가 하 고 즉시 RNA 침전을 실 온에서 10 분 동안 15 미 품에 대 한 vortexing에 의해 혼합.
- 작은 RNA에 4 ° C에서 10 분 동안 12000 x g 에서 원심. Pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- 75% 에탄올과 10에 대 한 소용돌이의 1 mL을 추가 s.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기에, 그리고 샘플 4 ° c.에 하룻밤 보관 - 4 ° c.에서 5 분 동안 7500 x g 에서 원심 분리기 Pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- 5.9-5.10 세척 단계를 반복 합니다. Pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 제거 하 고 증기 두건에 게 펠 릿 건조.
- Nuclease 무료 물 500 µ L에서 RNA 펠 릿을 녹이 고 얼음에 샘플을 계속. Microvolume 분 광 광도 계 또는 해당 장비와 함께 농도 측정 합니다. -80 ° c.에 RNA를 저장
6. 공동 추출된 제 브라와 Mycobacterial DNA의 정화
- Guanidine 안산 (최종 농도 4 M)의 118.2 g 나트륨 시트르산의 3.68 g을 용 해 하 여 다시 추출 버퍼 (애기) 준비 (최종 농도 50 m m)과 nuclease 무료 물 (이 5 월의 120 mL에서 트리 스 무료 자료 (최종 농도가 1 M)의 30.29 g 필요 하룻밤 교 반). Nuclease 무료 물 250 mL 및 소독 솔루션 필터의 최종 전체 볼륨을 추가 합니다.
참고:이 버퍼 저장할 수 있습니다 실 온에서 6 개월까지. 그들은 염화 수소 및 수소 시아 나 이드 독성 가스를 생산 하기 위해 반응으로 표 백제와 애기를 결합 하지 마십시오. - Mycobacterial DNA를 추출 하 고 interphase 샘플의 유기 단계를 사용 합니다. 각 튜브를 애기의 500 μ를 추가 합니다. 실 온에서 반전 하 여 10 분 동안 광범위 하 게 믹스.
- 실 온에서 30 분 동안 12000 x g 에서 튜브 원심 하 고 신중 하 게 새로운 튜브에 DNA를 포함 하는 위 수성 단계의 500 µ L를 전송.
- 2-프로 판 올의 400 μ를 추가 합니다. 반전 하 여 혼합 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 샘플을 원심 DNA를 포함 하는 펠 릿은이 시점에서 표시 되어야 합니다. 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한 제거.
- 70% 에탄올의 800 μ를 추가 합니다. 반전 하 여 펠 릿을 세척. 할 하지 소용돌이 샘플이 시점에서, 게놈 DNA 쉽게 나눈다.
- 4 ° C에서 15 분 동안 12000 x g 에서 샘플 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 제거 합니다. 에탄올 세척 (단계 6.6 6.7)를 반복 합니다.
- 신중 하 게 pipetting으로 에탄올을 제거 합니다. 샘플 5-10 분 해산 nuclease 무료 물 200 μ에 펠 릿에 대 한 건조 보자.
- Microvolume 분 광 광도 계 또는 해당 장비와 함께 DNA 농도 측정 합니다. DNA 또는 장기 저장을 위한-20 ° C에서 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.
7. 정량 PCR Mycobacterial 부하를 측정 하기 위한
- 아니-를 이용한 (카-X-rhodamine)는 M. marinum 내부 베낀된 스페이서 (ITS) MMITS1 뇌관 (표 1)와 함께 제조업체의 지침에 따라 16-23S ITS 사이 대 한과 정량 Pcr 반응 혼합을 준비 합니다. 반응 혼합 플라스틱 고 희석 96 잘 접시 정량에 적합에 중복으로. 각 실행에 알려진된 양의 박테리아의 DNA 표준 희석 시리즈를 포함 합니다.
참고: 예상 물고기 당 M. marinum 부하 4 wpi에서 1000000 CFU 0 CFU에서 배열할 수 있다. 정량 분석 결과 또한 다른 정량 키트와 함께 수행할 수 있습니다 하지만 뇌관의 어 닐 링 온도 다시 최적화 될 수 있다. - 광학 투명 필름으로 접시를 봉인 하 고 2000 x g 4 ° c.에 2 분 동안에 격판덮개 원심
- 표 2에 표시 된 정량 프로그램을 실행 합니다.
- 표준 곡선을 사용 하 여, 전체 물고기 샘플에서 박테리아의 수를 계산 합니다.
8. DNase RNA 샘플의 치료
- RNA에서 게놈 DNA의 모든 가능한 남아 있는 흔적을 제거 하려면 수행 DNase I 치료. 얼음에 RNA 샘플 녹여
참고: RNase 무료 장비 및 솔루션을 사용 하 여 작업 면 펫 RNases (자료 테이블) 작업을 시작 하기 전에 제거 오염 제거 시 약으로 닦아 해야 합니다. 긴 팔 랩 코트와 당신의 견본을 보호 하기 위해 장갑을 착용 하십시오. - 10 μ 준비 DNase I 반응 믹스 제조업체의 지침에 따라 얼음에. 믹스 1 μ DNase 나 DNase 버퍼 x 10의 1 μ, 8 μ RNA의 RNA의 1 μ g의 최대를 포함 한 샘플의.
- 부드럽게 반응 (vortexing)을 혼합 하 고 37 ° c.에 30 분 동안 품 어
- 열 비활성화 이전 각 10 µ L 샘플 50 mM EDTA의 1 µ L를 추가 합니다. EDTA는 추가 되지 않습니다, 만약 RNA 화학 저하 때가 열을 받게 된다.
- 열-비활성화 DNase I. 계속 cDNA 합성에 직접 또는 저장 DNase 취급 RNA-80 ° c.에 65 ° C에서 10 분 동안 품 어
9입니다. cDNA 합성
- 모든 시 약 및 얼음에 샘플을 유지 하 고 제조업체의 지침에 따라 반응 믹스를 준비. 5 μ 반응 혼합에 대 한 반전 전사 마스터 믹스의 1 μ, nuclease 무료 물 3 μ DNase의 1 μ 처리 RNA.
- 반전 녹음 방송 반응을 부드럽게 혼합 하 고 필요한 경우 짧게는 튜브를 회전.
- PCR 기계에 샘플을 배치 하 고 표 3에 표시 된 프로그램을 사용 하 여.
- 필요한 경우 nuclease 무료 물 2.5 ng/μ의 최대 농도를 정량에 cDNA를 희석. cDNA는-20 ° c.에 저장 될 수 있다
10. 양이 많은 PCR에 의해 Zebrafish 유전자 발현 측정
- 제조업체의 지침에 따라 얼음에 정량 마스터 믹스를 준비 하 고 빛 으로부터 보호. 표 1에 도입 된 프라이 머를 사용 합니다.
참고: 각 유전자에 대 한 유도의 배를 계산 하려면 식 6 건강 한 제 브라에서 추출한 풀링된 초기 샘플에서 측정 합니다. - 각 샘플의 복제를 준비 하 고 정량 플레이트에 반응 혼합 플라스틱. 광학 투명 필름으로 접시를 봉인 하 고 실행을 시작 하기 전에 2000 x g 4 ° C에서 2 분 동안에 격판덮개 원심.
- 실행은 정량 뇌관 쌍을에 따라 어 닐 링 온도와 표 4 에 표시 된 프로그램 사용 (표 1).
- 집 지키는 유전자 (loopern437)에 비해 유전자 식 비율 방정식을 사용 하 여 ΔCt 메서드 분석:
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Representative Results
진 균 marinum 자연 물고기 병원 체는 제 브라의 내부 장기를 감염 하 고 조직학 보이는 육아19조직의 감염을 생성 합니다. 성인 zebrafish M. marinum 복 주사에 의해 감염 됩니다. DNA와 RNA를 추출 하 고 mycobacterial 부하 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) DNA를 템플릿으로 사용 하 여 측정 된다. 방법의 개요는 그림 1에 표시 됩니다.
물고기를 감염 사용 mycobacteria의 초기 수 감염의 결과 대 한 중요 한 결정 이다. M. marinum (~ 2000 CFU)의 높은 감염 복용량 mycobacterial 로드 계속 평균 세균 부하는 궁극적으로 물고기를 죽이 약 5 백만 박테리아 (그림 2A)에 도달할 때까지 증가 진보적인 질병으로 이어집니다. 낮은 복용량 (~ 20-90 CFU) M. marinum 리드 (그림 2B) 인간의 결핵에서 비슷한 질병 스펙트럼의 개발에의. 세균 중 약 4-7 주 (그림 2A 및 그림 3A), 물고기의 대다수에서 후 질병 정상 상태에 도달할 때까지 증가 하 고 있습니다. 그림 2B 는 낮은 복용량 감염 질병 결과의 분포의 예를 보여 줍니다: 감염 된 zebrafish의 약 7%는 박테리아의 성장을 제한 하지 못했습니다. 이러한 개인 기본 진보적인 질병을 개발 하 고 그들은 감염 후 2 개월 이내에 사망 했다. 약 10%는 개인의 사주에 의해 mycobacterial 감염을 지워집니다. 물고기 인구의 나머지 65% 꾸준한 세균성 부담과 함께 잠재 mycobacterial 감염을 개발 했다. 그러나, 18%에서 감염의 8과 32 주 사이 잠재성 감염 저절로 다시 활성화 질병의 진행을 선도.
사용 하 여 걸 레-/- 돌연변이 물고기, 성인 물고기에 적응 면역 반응의 역할을 연구 하기 가능 하다. 걸 레-/- 돌연변이 물고기 충분히 높은 세균성 부하 (그림 3A)로 이어지는 mycobacteria의 성장을 제한할 수 없습니다 그리고 증가 된 병 적 (그림 3B), 명확 하 게 보여주는에 적응 면역의 중요성 제어 mycobacterial 감염입니다. 또한, mycobacterial 감염에 특정 cytokine 응답을 evoking에 적응 반응의 중요성이이 모델에서 공부 될 수 있다. 여기, 우리가 적응 응답은 인터 루 킨 4 (IL4)의 효율적인 유도에 필요한 표시 (그림 3C) 하지만 4 wpi (그림 3D)에서 인터페론-γ (IFNγ)의 유도 위해 불가결 이다. 인터페론-γ는 사이토카인 인터 루 킨 4 세포 외 병원 균에 대 한 적합 한 면역 반응에 일반적인 중재자는 세포내 병원 체에 대 한 응답을 운전. 야생-타입 그룹에 비해 il4 의 상당히 높은 식 수준의 걸 레-/- 돌연변이 물고기 mycobacterial 감염 (그림 3C)의 중요 한 적응 체액 응답을 말합니다.
그림 1: 성인 zebrafish mycobacterial 부하의 개발의 워크플로. 성인 zebrafish M. marinum의 복 주사와 감염 됩니다. DNA와 RNA는 물고기의 내부 장기에서 추출 되 고 M. marinum 부하 및 호스트의 면역 반응 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)으로 분석 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 성인 zebrafish에 M. marinum 의 주입 하면 질병의 스펙트럼. (A) 제 브라 (34 ± 15 CFU) 낮은 또는 높은 복용량 (2029 ±709 CFU) M. marinum의 주입 했다. 5 물고기에 대 한 하 중을 평균 (32 주 높은 복용량, n을 제외 하 고 = 2) sd. 낮은 복용량 통계와 함께 표시 됩니다: * p < 1 주에 비해 0.05 * * p < 0.05 1에 비해 2 주. 높은 복용량 통계: * * * p < 0.05 비해 1, 2, 8, 11, 20 wk. ¤ 높은 복용량 p 대 낮은 복용량 < 0.05. Parikka 외 에서 수정 201219. (B) M. marinum의 낮은 복용량과 함께 감염 된 야생-타입 zebrafish 인구 내의 질병 결과의 전형적인 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 적응 면역 성인 zebrafish에 mycobacterial 감염의 과정에 영향을 줍니다. 성인 야생-타입 (wt) 그리고 rag1 (−/−) zebrafish 낮은 복용량으로 감염 되었다 (n = 30) M. marinum의. (A) 평균 mycobacterial 중 2, 4, 및 7 주 게시물 감염 (wpi) 정량으로 측정 되었다 (n = 10) * P < 0.05. (B) 물고기 질병의 증상의 발전에 따라 안락사 했다 및 생존 플롯 창조 되었다. (C). il4 식 수준 4 wpi에서 측정 되었다. IFNγ 의 (D) 식 레벨 4 wpi에서 측정 되었다. (A와 B) 201219Parikka 외 에서 수정. (C, D) Hammarén 외. 201438에서 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 | 뇌관 순서 | 어 닐 링 온도 |
| MMITS1 | F: CACCACGAGAAACACTCCAA | 65 |
| 16S-23SITS 소재 시 AB548718 M. marinum 정량화에 대 한 | R: ACATCCCGAAACCAACAGAG | |
| loopern4 | F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT | 61 |
| 반복 요소를 표현 | R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG | |
| il4 | GCAGGAATGGCTTTGAAGGG | 59.5 |
| ZDB-유전자-100204-1 | GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT | |
| ifnγ1-2 | F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC | 61 |
| ZDB-진-040629-1 | R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT |
표 1: 뇌관 시퀀스 및 어 닐 링 온도. 사용 하는 뇌관의 순서 그리고 그들의 최적화 된 어 닐 링 온도. M. marinum 16-23S rRNA 사본에 대 한 프라이 머를 이용한 정량 키트를 포함 하 여에 대 한 아니오를 이용한 정량 키트와 다른 뇌관 최적화 되었습니다 했습니다.
| 단계 | 시간 | 온도 |
| 1 | 3 분 | 95 ° C |
| 2 | 5 s | 95 ° C |
| 3 | 10 s | 65 ° C |
| 4 | 5 s | 72 ° C (형광 탐지) |
| 5 | 단계 2로 이동 합니다. 39 번 | |
| 6 | 녹는 곡선 분석 55-95 ℃ 0.5 ℃ 간격 | |
| 7 | 영원히 | 4 ° C |
표 2: M. marinum DNA를 측정 하기 위한 정량 프로그램. 정량 Pcr 프로토콜 제조업체의 지침에 따라 설계 및 zebrafish 샘플에서 M. marinum DNA를 측정 하기 위한 최적화 된.
| 시간 | 온도 |
| 5 분 | 25 ° C |
| 30 분 | 42 ° C |
| 5 분 | 85 ° C |
| 영원히 | 4 ° C |
표 3: cDNA 합성 프로그램. 제조업체의 지침에 따라 감염 된 zebrafish의 추출 된 RNA 로부터 cDNA를 합성에 대 한 프로토콜.
| 단계 | 시간 | 온도 |
| 1 | 30 s | 95 ° C |
| 2 | 12 s | 95 ° C |
| 3 | 30 s | ° C를 어 닐 링 |
| 4 | 단계 2로 이동 합니다. 39 시간에 대 한 | |
| 5 | 녹는 곡선 분석 65-95 ℃ 0.5 ℃ 간격 | |
| 6 | 영원히 | 4 ° C |
표 4: 호스트의 유전자 발현을 측정 하기 위한 정량 프로그램. 정량 Pcr 프로토콜 제조업체의 지침에 따라 설계 및 표현의 zebrafish 다른 유전자를 측정 하기 위한 최적화 된.
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Discussion
여기는 실험적으로 감염 된 성인 zebrafish 조직에서 추출한 DNA에서 mycobacterial 로드를 측정 하는 정량 기반 응용 프로그램에 설명 합니다. 이 응용 프로그램은 뇌관 16S 23S rRNA 내부 베낀된 공백 시퀀스40설계를 기반으로 합니다. 생선 샘플에서 총 mycobacterial 부하 DNA 교양된 mycobacteria의 알려진된 수에서 추출 하 고 어떤 주어진된 순간에 그 한 박테리아는 그것의 게놈의 복사본이 하나 가정에서 준비 하는 표준 곡선을 사용 하 여 추정 된다. M. marinum-정량의 검출 한계는 약 100 단위18를 형성 하는 식민지. 전통적인 도금에 비해 방법의 명확한 이점은 활성 및 비 분할 휴면 박테리아 검출 될 수 있다 이다. 또한, zebrafish 조직에서 문화 접시에 오염 성장의 일반적인 문제는이 접근 방식에 의해 피할입니다. 그러나, DNA는 템플릿으로 사용 되는 경우, 측정 복사본 중 일부는 아주 최근에 죽은 박테리아의 DNA에서 파생 될 수 있다 가능 하다. 핵 산 기반 프로토콜의 중요 한 이점은 이다 모두 DNA와 RNA 뿐만 아니라 (단백질, 여기에 설명 하지 않은) 동일한 개인에서 추출 수 있습니다로 개인의 mycobacterial 부하는 둘 다의 유전자 표현 데이터와 결합할 수는 호스트 고 박테리아입니다.
M. marinum 의 주입은 감염의 결과의 중요 한 결정 이다. 낮은 M. marinum (~ 20-90 CFU) 가장 일반적인 형태로 대기 시간이 질병의 스펙트럼을 생산 하는 감염 복용량. 감염 복용량 수천의 순서 인 경우에, 개인의 대다수에 더 진보적인 질병 개발 한다. 자연 감염 복용량 인간의 결핵41에 낮은 것으로 알려져 더 자연 감염을 생산할 가능성이 이다 zebrafish 모델에서 M. marinum 의 낮은 복용량을 사용 하 여. 도달 하기 위해 정확한 복용량, OD600와 어떤 실험을 시작 하기 전에 콜로 니 형성 단위 사이의 관계를 확인 해야 합니다. 도금된 감염 복용량의 정상 변이 약 30% 이며 문제가 간주 되지 않습니다. 그러나, 그것은 세균 현 탁 액의 전체 5 µ L 볼륨 물고기 안에 남아 확인 해야 합니다. 주입 솔루션의 새 감염 복용량에 추가 변이 발생 합니다. 감염 복용량 이외에 박테리아의 긴장 수 질병의 진행에 영향을. 그것 되었습니다 그 독성 표시 다른 M. marinum 의 긴장 긴장 사이 변경할 수 있습니다. 두 가장 일반적으로 사용 되 긴장은 ATCC927 (이 실험에 사용 된 절연된 스트레인 생선)와 M 스트레인. 그러나, 이러한 긴장 그들의 독성에 크게 차이가 있습니다. 인간 절연 M 스트레인 물고기 절연 변형 생성 온화한 질병을 잘-적합33mycobacterial 감염 잠재적인 형태를 공부 하는 반면 더 진보적인 질병을 개발 한다. 내 긴장 박테리아의 독성 박테리아는 순차적으로 한 문화에서 다른 전송 냉장고에서 신선한 mycobacteria을 취 함으로써 예방할 수 있습니다 어떤 경우에 또한 변경할 수 있습니다 자주 만큼 재고.
생체 외에서 천천히 항생제 없이 M. marinum 을 분리 배양 하는 것은 오염 하는 경향이입니다. 따라서, 박테리아의 처리 층 류 두건에서 실시 하는 엄격한 무 균 접근을 해야 합니다. 가능한 오염 문화에는 너무 높은 OD600 값으로 검출 될 수 있다 이상한 세균 정지 또는 식민지. M. marinum 식민지는 일반적으로 퍼지 상승, 평평 하 고 매트 화이트 색상. M. marinum 문화는 빛에 민감 하다 고 그들은 빛에 노출 되 면 노란색 안료 생산 시작. 감염 후 다른 박테리아에서 M. marinum 식민지를 구별 하는 것이 노란색 색소를 사용할 수 있습니다. 오염 물질은 감염 후 곧 죽는 물고기를 발생할 수 있습니다. 일반적으로, 낮은 복용량 감염의 첫 번째 증상 전에 3 주 게시 감염 되며이 시간 포인트 전에 어떤 mortalities 오염으로 인해 세균 학이 나 외상 유도 주입 동안에 표시 되지 않습니다.
성인 제 브라 3 aminobenzoic 산 에틸 에스테 르에 매우 민감합니다 그리고 노출 시간이 너무 깁니다 또는 마 취의 농도 너무 높은 경우 생존 하지 않습니다. 따라서, 감염 때는 제 브라 노출 되어야 좋은 마 취를 달성 하기 위해 시간이 최소에만 마 취 (~ 1-2 분). 감염, 후 성인 zebrafish 26-28 ° c.의 온도에 그룹에 보관 됩니다. 온도가 높거나 이것 보다 낮은 경우에, 그것은 M. marinum 성장 율 및 감염의 활동 영향을 수 있습니다. 또한, 탱크 수 질 (미생물 품질, 소금 농도, pH, 산소 포화) 성공적인 실험을 보장 하는 중요 한 부분입니다. 물고기의 상태 모니터링 그룹에서 제거 하 여 안락사 해야 감염의 증상을 보여 주는 생선과 매일 실시 될 필요가 있다. 물고기 탱크에 죽고, 다른 물고기에 감염의 진행에 영향을 미칠 것입니다, 용기를 통해 재감염 될 수 있습니다.
결핵의 일반적으로 사용 되 zebrafish 애벌레 모델 호스트-미생물 상호작용의 제한 된 하위 집합에 실험을 지휘 연구 타고 난 면제에 적용 됩니다. 성인 제 브라를 사용 하 여 다재 다능 한 모델18,,3239에 타고 난 및 적응형 면역 반응 연구를 가능 하 게. 성인 zebrafish 모델로 편리한 척추 결핵의 전체 스펙트럼을 연구 자체를 선물 한다. M. marinum의 낮은 복용량 노출, 물고기 인구의 7% 개발 1 차 진보적인 질병, 10% 소독 감염 수 있습니다, 그리고 잠재성 질병을 개발 하는 65%와 18%에서 자연 스러운 재 발생 (그림 2). 생산 하는 인간의 결핵, 있는 대부분 개발 잠재성 질병, 약 4-14%에서 감염42, 10-20%의 후 첫 5 년 이내 1 차 활성 감염 많이 유사 질병 스펙트럼 노출 된 사람 감염43 소독 수 것과 잠재 감염의 5-10%44활성화. 호스트의 유전학에 차이 결핵 및 질병 진행45에 민감성을 영향을 줍니다. 이것은 또한 많은 다른 실험실 동물46,47달리 매우 이질적인 유전자가 zebrafish 인구에서 보인다. 자연 유전 변이 하기가 매우 적용 모델이 multifactorial 질병에 최적의 면역 반응에 대 한 검색.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품으로는 핀란드 문화 재단 (H.L.), 템 퍼 결핵 재단 (H.L., L. M.V. M.M.H., M.P.), 핀란드 결핵 협회 (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., 재단 지원 되었습니다. M.M.H., M.P.), Sigrid Jusélius 재단 (M.P.), 에밀 Aaltonen 재단 (M.M.H.), 제인 및 Aatos Erkko 재단 (M.P.)와 핀란드의 아카데미 (M.P.). Leena Mäkinen, 한 나-Leena Piippo 및 제 나 Ilomäki에 그들의 기술 지원을 인정 됩니다. 저자는 그들의 서비스에 대 한 템 퍼 Zebrafish 실험실을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mycobacterium marinum | American Type Culture Collection | ATCC 927 | |
| Middlebrock 7H10 agar | BD, Thermo Fisher Scientific | 11799042 | |
| Middlebrock OADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Middlebrock 7H9 medium | BD, Thermo Fisher Scientific | 11753473 | |
| Middlebrock ADC enrichment | BD, Thermo Fisher Scientific | 11718173 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| GENESYS20 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Phosphate buffered saline tablets (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| 27 G needle | Henke Sass Wolf | 4710004020 | |
| 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200V0 | |
| Omnican 100 30 G insulin needle | Braun | 9151133 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 1.5 mL homogenization tube | Qiagen | 13119-1000 | |
| 2.8 mm ceramic beads | Qiagen | 13114-325 | |
| Ethanol, ETAX Aa | Altia | ||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
| Chloroform | VWR | 22711.290 | |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277 | FW 118.2 g/mol |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 1613859 | FW 294.1 g/mol |
| Tris (free base) | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | FW 121.14 g/mol |
| TRI reagent | Molecular Research Center | TR118 | Guanidine thiocyanate-phenol solution |
| PowerLyzer24 homogenizator | Qiagen | ||
| Sonicator m08 | Finnsonic | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix | Bioline | BIO-98005 | |
| qPCR 96-well plate | BioRad | HSP9601 | |
| Optically transparent film | BioRad | MSB1001 | |
| C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system | BioRad | ||
| RNase AWAY | Thermo Fisher Scientific | 10666421 | decontamination reagent eliminating RNases |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0525 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Fluidigm | 100-6298 | |
| SsoFast Eva Green master mix | BioRad | 172-5211 |
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