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Immunology and Infection

Modelagem de tuberculose no Zebrafish adulto infectado de Mycobacterium marinum

Published: October 8, 2018 doi: 10.3791/58299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para tuberculose humana de modelo em um adulto zebrafish usando seu patógeno natural Mycobacterium marinum. Extraído DNA e RNA de órgãos internos de zebrafish infectado podem ser usado para revelar que o total micobacteriana carrega no peixe e as respostas de imune do hospedeiro com qPCR.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis é atualmente o mais mortífero patógeno humano causando infecções 10,4 milhões e 1,7 milhões de mortes todos os anos. Exposição a esta bactéria faz com que um espectro largo de doença em seres humanos, que vão desde uma infecção esterilizada para uma doença mortal ativamente progredindo. A forma mais comum é a tuberculose latente, que é assintomática, mas tem o potencial para reativar a uma doença fulminante. Zebrafish adulto e seu patógeno natural Mycobacterium marinum recentemente provaram para ser um modelo aplicável para estudar o espectro de doença ampla de tuberculose. Importante, espontânea latência e reativação, bem como adaptáveis respostas imunes no contexto da infecção micobacteriana pode ser estudadas neste modelo. Neste artigo, descrevemos os métodos para a infecção experimental de zebrafish adulto, a coleção dos órgãos internos para a extração de ácidos nucleicos para a medição das cargas micobacterianas e acolhimento respostas imunes por PCR quantitativo. O in desenvolvido internamente, M. marinum -ensaio de qPCR específico é mais sensível que os métodos tradicionais de chapeamento como também detecta DNA de micobactérias não-dividindo, dormentes ou recentemente mortas. Como o DNA e o RNA são extraídos do mesmo indivíduo, é possível estudar as relações entre o estado doente e a expressão do gene hospedeiro e patógeno. O modelo adulto zebrafish para tuberculose, portanto, apresenta-se como um sistema altamente aplicável, não-mamíferos na vivo para estudar interações patógeno-hospedeiro.

Introduction

Peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal amplamente utilizado na investigação biomédica e é um modelo aceito para a biologia de vertebrados comum. O zebrafish foi adaptada a muitos campos de pesquisa modelagem de doenças humanas e desordens que variam de câncer1 e doença cardíaca2 a infecção e estudos imunológicos de várias bactérias 3 e infecções virais4 , 5. Além disso, o ex utero desenvolvimento de embriões de zebrafish fez o zebrafish um modelo popular em biologia do desenvolvimento-6 e toxicologia7,8.

Em muitos campos de investigação, incluindo a biologia da infecção, as larvas de zebrafish opticamente transparente são comumente usadas. As primeiras células imunes aparecem dentro fertilização post de 24 h (hpf), quando os macrófagos primitivos são detectados9. Os neutrófilos são as células imunitárias próximo a aparecer por volta de 33 hpf10. Zebrafish larvas são, portanto, viáveis para o estudo da fase inicial da infecção e o papel da imunidade inata na ausência de células do sistema imune adaptativo11. No entanto, o zebrafish adulto com seu totalmente funcional sistema imune adaptativo fornece uma camada adicional de complexidade para experimentos de infecção. Células T podem ser detectadas em torno de 3 dias pós fertilização12, e as células B são capazes de produzir anticorpos funcionais por 4 semanas pós fertilização13. O peixe-zebra adulto tem todas as principais contrapartes do mamífero sistema imune inato e adaptativo. As principais diferenças entre o immune systems de peixe e os seres humanos são encontradas no anticorpo isotipos, bem como a anatomia dos tecidos linfoides. O peixe-zebra tem anticorpo apenas três classes14, Considerando que os seres humanos têm cinco15. Na ausência de medula óssea e gânglios linfáticos, os órgãos linfoides primários no peixe são o rim e o Timo16 e o baço, o rim e o intestino servem como órgãos linfoides secundários17. Apesar dessas diferenças, com seu arsenal completo imune das células inatas e adaptativas, o zebrafish adulto é um modelo altamente aplicável, fácil de usar, não-mamíferos para estudos de interação patógeno-hospedeiro.

O zebrafish ultimamente foi estabelecido como um modelo viável de estudar tuberculose18,19,20,21,22. A tuberculose é uma doença no ar, causada pelo Mycobacterium tuberculosis. De acordo com a Organização Mundial de saúde, tuberculose causou1,7 milhões de mortes em 2016 e é a principal causa de morte por um patógeno único no mundo23. Os ratos24,25, coelhos26 e primatas não-humanos27 são que o animal mais conhecido modelos na pesquisa de tuberculose, mas cada rosto suas limitações. O modelo de primatas não humanos de M. tuberculosis infecção da doença humana assemelha-se mais intimamente, mas usar este modelo é limitado devido a considerações éticas graves. Outros modelos animais são prejudicados pela anfitrião-especificidade de M. tuberculosis que afeta a patologia da doença. Provavelmente o maior problema na modelagem de tuberculose é o amplo espectro de infecção e doença resultados na doença humana: a tuberculose é uma doença muito heterogênea, variando de esterilização imunidade a infecção latente, ativa e reativada28 , que pode ser difícil de reproduzir e modelo experimentalmente.

Mycobacterium marinum é um parente próximo do M. tuberculosis com proteínas de ortólogos ~ 3.000 com 85% de identidade de aminoácidos29. M. marinum naturalmente infecta zebrafish produzir granulomas, as principais características da tuberculose, em seus órgãos internos19,30. Ao contrário de outros modelos animais utilizados na pesquisa de tuberculose, zebrafish produz muitos filhos, requer apenas um espaço limitado e importante, neurophysiologically é o modelo de tuberculose vertebrados menos desenvolvido disponível. Além disso, a M. marinum infecção causa infecção latente, doença ativa ou mesmo esterilização da infecção micobacteriana no zebrafish adulto intimamente imitando o espectro dos resultados de doença da tuberculose humana19, 31 , 32. aqui, descrevemos os métodos para o modelo experimental de tuberculose de adultos do zebrafish injetando M. marinum na cavidade abdominal e usando PCR quantitativo para medir a cargas micobacterianas e respostas imunes de zebrafish amostras de tecido.

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Protocol

Todos os experimentos de zebrafish foram aprovados pelo Conselho de experimento Animal na Finlândia (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Métodos são executados de acordo com a lei (497/2013) e do Decreto do governo (564/2013), relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos ou educacionais na Finlândia.

1. cultivo de Mycobacterium marinum

Nota: Desde que o Mycobacterium marinum é um patógeno capaz de causar infecções superficiais nos seres humanos, descobrir as diretrizes locais para segurança pessoal e eliminação de resíduos de risco biológico antes de começar a trabalhar com esta bactéria.

  1. Cultura de M. marinum em um 7 H 10 placa suplementado com 10% OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, catalase) enriquecimento e 0,5% v/v de glicerol a 29 ° C durante pelo menos 5 dias. Manter as culturas de M. marinum tomando frescas bactérias do congelador a cada duas semanas e transferir para um prato novo toda semana.
    Nota: M. marinum é um patógeno de peixe natural infectar espécies aquáticas e é importante tomar precauções para não contaminar o zebrafish existências com as bactérias. Zebrafish infectado e itens contaminados com bactérias devem ser mantidas separadas das instalações da reprodução.
  2. Usar um loop de inoculação de 1 µ l estéril para transferir assepticamente uma loopful de M. marinum massa bacteriana em um frasco de cultura de células contendo 10 mL de 7h 9 médio com enriquecimento de ADC (albumina, glicose, catalase) 10%, 0,2% v/v Polissorbato 80 e 0,2% v/v de glicerol. Cultura por 3 – 4 dias para aproximadamente uma OD600 (densidade óptica) de 0,7 a 29 ° C, no escuro sem tremer. Deixar a tampa solta, ou use uma tampa de filtro, para permitir o intercâmbio suficiente de gases.
    Nota: Polissorbato 80 é adicionado ao meio para evitar a agregação das bactérias. Além disso, a exposição à luz conduz a alterações fenotípicas em colônias bacterianas (por exemplo, a cor muda de branco para amarelo). Para evitar isso, mantenha as culturas no escuro.
  3. Medir o valor de600OD com um espectrofotômetro. Diluir a cultura líquida para uma OD600 de 0,07 – 0,09 e continuar o cultivo por 2 dias a 29 ° C, no escuro, sem tremer. Deixe a tampa solta.
    Nota: Durante estes dois dias, a suspensão bacteriana alcançará uma OD600de aproximadamente 0,5 correspondente a uma fase inicial de registro.

2. preparação da solução bacteriana por infectar adulto Zebrafish

  1. Transferir a suspensão bacteriana em uma cubeta grande estéril ou um tubo de 15 mL e colocá-lo no escuro à temperatura ambiente por 15 min permitir que os grupos maiores resolver.
  2. Transferir o top 5-7 mL da suspensão para um tubo limpo ou uma cubeta e medir o OD600. Use esta fase superior da suspensão para as infecções.
  3. Colete 1 mL de cultura de M. marinum em um tubo fresco e centrifugar para 3 min a 10.000 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de PBS 1x estéril.
  4. Diluir a alcançar a concentração bacteriana desejada usando estéril 1 x PBS com 0,3 mg/mL de vermelho de fenol como um traçador. Divida a suspensão diluída em três alíquotas.
    Nota: Use um pré-determinado OD600 vs UFC (unidades formadoras de Colônia) / curva µ l para estimar a diluição necessária para obter o número procurado de bactérias a injeção de 5 µ l volume34. A correlação entre a concentração da suspensão bacteriana e OD600 precisa ser validado antes de iniciar os experimentos de infecção real. Reserva duas semanas para coletar esses dados de validação.
  5. Utilizando uma seringa de 1 mL, lentamente puxar a suspensão através de um 27G agulha x 3. Para cada alíquota, execute esta etapa antes do uso.
    Nota: Não use a mesma solução bacteriana para mais de 2 h.

3. experimental M. marinum infecção com injeção Intraperitoneal

  1. Pipetar uma gotícula de 5 µ l da solução diluída em um pedaço de filme de parafilm bacteriana e puxar a gota em uma agulha de insulina 30g.
  2. Use 5 – 8 mês-velho selvagem-tipo peixe e peixes mutantes de rag1−/−hu1999 para o experimento. Anestesia o zebrafish adulto na água tanque com éster de ácido etil 3-aminobenzoico 0,02% (pH 7,0). Posicione o lado ventral do peixe acima em uma fenda em um plástico espumado húmida.
    Nota: Rag-/- peixes mutantes não são capazes de se submeter a recombinação somática e produzir células T e B funcionais.
  3. Injetar a agulha entre as nadadeiras pélvicas em um ângulo de aproximadamente 45°. Manter a abertura da agulha para cima para observar que a abertura inteira está dentro da cavidade abdominal. Injetar lentamente a suspensão bacteriana e Retire cuidadosamente a agulha.
    Nota: no caso do marcador vermelho está vazando o peixe em cima da injeção, exclua o peixe do experimento.
  4. Imediatamente após a injeção, transferi os peixes em um tanque de recuperação com água fresca.
  5. Tirar amostras da suspensão bacteriana em 7H 10 placas a cada 15 min da alíquota em uso o bacteriano e incubar a bactéria a 29 ° C durante 5 dias e verificar se a dose de infecção através da contagem das colônias nas placas.
  6. Verifique regularmente se o bem-estar dos peixes e eutanásia qualquer peixe com sintomas da infecção com mais de 0,02% concentração de éster de ácido etil 3-aminobenzoico (pH 7.0).
    Nota: Aproximadamente, 7% do zebrafish adulto infectado com 34 ± UFC 15 e 30% de zebrafish infectado com 2029 ± 709 CFU por 8 semanas19terá tido sintomas. Os sintomas podem incluir natação anormal, falta de resposta ao toque, ofegante, edema ou desperdiçar observáveis.
  7. Manter o zebrafish de acordo com os padrões comuns35.

4. cobrança dos órgãos internos

  1. Eutanásia o zebrafish com uma overdose de éster de ácido etil 3-aminobenzoico (mais de 0,02% de concentração, pH 7,0) na água do tanque.
  2. Inserir um pino posterior para os raios branquiostegais e outra através da cauda para virar o peixe para a plataforma.
  3. Abrir a cavidade abdominal todo com um bisturi e coletar os órgãos internos, usando uma colher pequena e uma pinça de pontas afiadas. Começar do coração e ao longo da espinha para a cauda para desanexar todos os órgãos internos em um bloco.
    Nota: Certifique-se de recolher todo o tecido renal por raspagem ao longo da espinha com a colher.
  4. Finalmente, use uma pinça para desanexar o intestino ao lado da cloaca e transferir os órgãos em um tubo de homogeneização de 1,5 mL com seis esferas de cerâmica de 2,8 mm. Coloca imediatamente em gelo seco para congelar a amostra. A amostra pode ser armazenada a-80 ° C até homogeneizado.
  5. Lave os instrumentos com etanol a 70% entre os indivíduos.

5. homogeneização e RNA extraído um bloco de órgão.

Nota: O método é modificado da Universidade de Stanford protocolos36.

  1. Adicionar a solução de fenol-tiocianato de guanidina usada para extração de ácidos nucleicos (Tabela de materiais) na parte superior da amostra para um volume total de 1.500 µ l. Certifique-se de que a amostra abrange um máximo de 10% do volume total.
    Atenção: O volume esperado do tecido colhido é 100 µ l. guanidina tiocianato-solução de fenol contém tóxico e irritante compostos e exige roupas de proteção, luvas de nitrilo e trabalhando em uma coifa. Não combinam com água sanitária porque isso poderá provocar a formação de gases tóxicos. Leia a folha de dados de segurança do material (MSDS) antes do uso.
  2. Homogeneizar as amostras usando um homogeneizador de grânulo batendo 3 vezes para 40 s a 3.200 rpm. Legal no gelo por 30 s entre os ciclos. Proceda à sonicação as amostras homogeneizadas num banho de água durante 9 min.
  3. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e mover 1.000 µ l do homogenate apurada em um tubo de microcentrifugadora fresco.
  4. Adicione 200 µ l de clorofórmio, imediatamente misture vortexing por 15 s e incubar por 2 min à temperatura ambiente.
    Cuidado: Clorofórmio é um tóxico e irritante composto se inaladas, ingeridas ou em contato com a pele ou olhos. Usar equipamento de segurança necessário para a proteção pessoal e trabalho em uma coifa. Leia a folha de dados de segurança do material (MSDS) antes do uso.
  5. Centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C para separar as fases aquosas e orgânicas.
  6. Transferi com cuidado, 500 µ l da fase superior para um tubo fresco para não poluir o RNA. Remover e descartar o resto da fase aquosa (~ 100 µ l) e armazenar a interfase e a fase orgânica a 4 ° C para a extração de DNA.
    Nota: A fase superior contém o RNA.
  7. Adicionar 500 µ l de 2-propanol e imediatamente misture num Vortex durante 15 s. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente precipitar o RNA.
  8. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para o RNA de Pelotas. Retire o sobrenadante por pipetagem.
  9. Adicionar 1 mL de etanol 75% e vórtice por 10 s.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras mantidas durante a noite a 4 ° C.
  10. Centrifugar a 7.500 x g por 5 min a 4 ° C. Retire o sobrenadante por pipetagem.
  11. Repita as etapas de lavagem 5.9-5.10. Remover o sobrenadante cuidadosamente pipetando e deixar o sedimento secar ao ar livre em uma coifa.
  12. Dissolva a pelota do RNA em 500 µ l de água livre de nuclease e manter as amostras no gelo. Medir as concentrações com um espectrofotômetro microvolume ou equipamento equivalente. Armazenar o RNA a-80 ° C.

6. purificação de Zebrafish co extraído e DNA micobacteriana

  1. Preparar uma volta-solução tampão (BEB) dissolvendo 118,2 g de tiocianato de guanidina (concentração final 4 M), 3,68 g de citrato de sódio (concentração final 50mm) e 30,29 g de Tris base livre (concentração final de 1 M) em 120 mL de água livre de nuclease (maio deste exigem que a agitação durante a noite). Adicione água nuclease livre para um volume total final de 250 mL e filtro para esterilizar a solução.
    Nota: Esta reserva pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses. Não combine BEB com lixívia como eles reagem para produzir gases tóxicos tais como o cloreto de hidrogênio e cianeto de hidrogênio.
  2. Use a interfase e a fase orgânica da amostra para extrair DNA de micobactérias. Adicione 500 μL de BEB a cada tubo. Misture-se extensivamente por 10 min por inversão à temperatura ambiente.
  3. Centrifugar os tubos a 12.000 x g por 30 min à temperatura ambiente e 500 µ l da fase aquosa superior contendo o DNA para um novo tubo de transferência com cuidado.
  4. Adicione 400 μL de 2-propanol. Misture por inversão e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  5. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C. Neste ponto, uma pastilha que contém o DNA deve ser visível. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.
  6. Adicione 800 μL de etanol a 70%. Lave o pellet por inversão. Fazer não vórtice neste momento, as amostras como DNA genômico quebra facilmente.
  7. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C e retire o sobrenadante por pipetagem. Repeti a lavagem de etanol (etapas 6.6 e 6.7).
  8. Remova o etanol pipetando cuidadosamente. Deixe que as amostras secar ao ar por 5-10 min. dissolva a pelota em 200 μL de água livre de nuclease.
  9. Medir as concentrações de DNA com um espectrofotômetro microvolume ou equipamento equivalente. DNA pode ser armazenado a 4 ° C ou a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.

7. quantitativo PCR para medir cargas micobacterianas

  1. Prepare misturas de reação qPCR com n-ROX (carboxi-X-rodamina) contra o M. marinum espaçador interno transcrito (ITS) entre 16S-23S ITS de acordo com as instruções do fabricante com primers MMITS1 (tabela 1). Pipetar o mix de reação e diluições da amostra como duplicatas em uma placa de 96 poços apropriada para qPCR. Incluem uma série de diluição padrão de DNA de uma quantidade conhecida de bactérias em cada execução.
    Nota: O esperado M. marinum carga por peixes pode variar de 0 UFC UFC 1.000.000 no wpi 4. O ensaio de qPCR também pode ser realizado com outros kits de qPCR, mas a temperatura do recozimento para as primeiras demão deve ser re-otimizado.
  2. A placa com uma película opticamente transparente do selo e centrifugar a placa a 2.000 x g por 2 min a 4 ° C.
  3. Execute o programa de qPCR mostrado na tabela 2.
  4. Usando a curva de calibração, calcule o número de bactérias na amostra peixe inteiro.

8. DNase tratamento das amostras de RNA

  1. Para remover todos os restos possíveis de DNA genômico de RNA, realizar DNase eu tratamento. Descongele as amostras de RNA no gelo.
    Nota: Certifique-se de usar apenas equipamento livre de RNase e soluções e limpe a superfície de trabalho e as pipetas com um reagente de descontaminação eliminando RNases (Tabela de materiais) antes de começar a trabalhar. Vestir um jaleco de mangas compridas e luvas para proteger suas amostras.
  2. Prepare-se 10 μL DNase misturas de reação no gelo, de acordo com as instruções do fabricante. Misturar 1 μL de DNase I, 1 μL de 10x buffer de DNase e 8 μL do RNA da amostra incluindo um máximo de 1 μg de RNA.
  3. Delicadamente misture as reações (não num Vortex) e incube por 30 min a 37 ° C.
  4. Antes da calor-inactivação, adicione 1 µ l de 50 mM EDTA para cada 10 µ l da amostra. Se o EDTA não é adicionado, o RNA vai sofrer degradação química quando aquecido.
  5. Incubar durante 10 minutos a 65 ° C e calor-inativar DNase I. continuar diretamente para a síntese do cDNA ou armazenar o RNA DNase-tratados a-80 ° C.

9. síntese de cDNA

  1. Manter todos os reagentes e amostras no gelo e preparar a mistura de reação, de acordo com as instruções do fabricante. Para uma mistura de reação 5 μL, incluem 1 μL da mistura de mestre de transcrição reversa, 3 μL de água livre de nuclease e 1 μL de DNase tratados do RNA.
  2. Misture suavemente as reações de transcrição reversa e brevemente girar o tubo, se necessário.
  3. Colocar as amostras em uma máquina PCR e usar o programa mostrado na tabela 3.
  4. Dilua o cDNA em água livre de nuclease para qPCR para uma concentração máxima de 2,5 ng/μL, se necessário. o cDNA pode ser armazenado a-20 ° C.

10. medir a expressão gênica de Zebrafish por PCR quantitativo

  1. Preparar uma mistura de mestre qPCR no gelo, de acordo com as instruções do fabricante e proteja da luz. Use os primers apresentados na tabela 1.
    Nota: Para calcular a dobra de indução para cada gene, medir a expressão também a partir de uma amostra de linha de base em pool extraída 6 zebrafish saudável.
  2. Preparar as repetições de cada amostra e pipetar as misturas de reação em um prato de qPCR. A placa com uma película opticamente transparente do selo e centrifugar a placa a 2.000 x g por 2 min a 4 ° C antes de iniciar a execução.
  3. Executar o qPCR programa mostrado no quadro 4 , com a temperatura do recozimento dependendo do par de primer utilizado (tabela 1).
  4. Analise a relação de expressão do gene em comparação com um gene de domésticas (loopern437) com o método de ΔCt através da equação:
    Equation

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Representative Results

O patógeno de peixe natural Mycobacterium marinum infecta os órgãos internos do peixe-zebra e produz uma infecção sistêmica com granulomas histologicamente visível19. Zebrafish adulto estão infectados com M. marinum por uma injeção intraperitoneal. O DNA e RNA são extraídos, e a carga de micobactérias é medida pela reacção em cadeia do polymerase quantitativa (qPCR) usando o DNA como o modelo. O contorno do método é mostrado na Figura 1.

O número inicial de micobactérias utilizados para infectar o peixe é um determinante crítico para o resultado da infecção. Uma dose elevada de infecção de M. marinum (~ 2.000 CFU) leva a uma doença progressiva em que as cargas micobacterianas continuam a aumentar até que a carga bacteriana média atinge cerca 5 milhões de bactérias (Figura 2A), finalmente, matando os peixes. Uma dose baixa (~ 20-90 CFU) de M. marinum leva ao desenvolvimento de um espectro de doença semelhante à observada na tuberculose humana (Figura 2B). A carga bacteriana continua a aumentar até ao redor 4 – 7 semanas (Figura 2A e 3A figura), após o qual a maioria dos peixes, a doença atinge um estado estacionário. Figura 2B mostra um exemplo da distribuição dos resultados de doença com uma infecção de baixa dose: cerca de 7% do zebrafish infectado foram incapazes de restringir o crescimento bacteriano. Esses indivíduos desenvolveram uma doença progressiva primária e morreram no prazo de dois meses após a infecção. Aproximadamente 10% dos indivíduos desmarcada a infecção micobacteriana por 4 semanas. Os restantes 65% da população de peixes desenvolveu uma infecção micobacteriana latente com encargos bacterianas constantes. No entanto, entre 8 e 32 semanas de infecção, em 18%, a infecção latente reativada espontaneamente líderes para a progressão da doença.

Usando rag-/- peixes mutantes, é possível estudar o papel do adaptativos respostas imunes no peixe adulto. Rag-/- peixes mutantes suficientemente não podem limitar o crescimento das micobactérias levando cargas bacterianas (Figura 3A) e aumento de morbilidade (Figura 3B), demonstrando claramente a importância da imunidade adaptativa em controlando a infecção micobacteriana. Também, a importância de respostas adaptáveis em evocar certas respostas de citocinas na infecção micobacteriana pode ser estudada neste modelo. Aqui, nós mostramos que a resposta adaptativa é necessária para a indução eficiente de interleucina 4 (IL4) (Figura 3), mas é dispensável para a indução de interferon-γ (relato) no 4 wpi (Figura 3D). Interferon-γ é uma citocina dirigindo a resposta contra patógenos intracelulares considerando interleucina 4 é um mediador comum na resposta imune adaptativa contra patógenos extracelulares. Os níveis de expressão significativamente maiores de il4 no grupo selvagem-tipo em relação ao rag-/- peixes mutantes refere-se a importantes respostas humorais adaptativas na infecção micobacteriana (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: fluxo de trabalho de estudar o desenvolvimento de cargas micobacterianas no zebrafish adulto. Zebrafish adulto estão infectados com a injeção intraperitoneal de M. marinum. DNA e RNA são extraídos órgãos internos do peixe e a carga de M. marinum e respostas de imune do hospedeiro são analisadas com reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Injeção de M. marinum no zebrafish adulto faz com que um espectro de Estados de doença. (A) Zebrafish foram injetados com uma baixa (34 ± 15 UFC) ou uma dose alta (2029 ±709 CFU) de M. marinum. Média de cargas para 5 peixes (exceto dose alta de 32 semanas, n = 2) são mostrados com estatísticas SD. Low-dose: * p < 0.05 comparado com 1 semana, * * p < 0.05 comparado com 1 e 2 semana. Estatísticas do elevado-dose: * * * p < 0.05 comparado com 1, 2, 8, 11 e 20 semana ¤ baixa dose vs alta dose p < 0,05. Modificado de Parikka et al 2012,19. (B) distribuição típica dos resultados da doença dentro de uma população selvagem-tipo zebrafish infectados com uma dose baixa de M. marinum. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: imunidade adaptativa afeta o curso da infecção micobacteriana no zebrafish adulto. Selvagem-tipo adulto (wt) e rag1 (−/−) zebrafish foram infectados com uma dose baixa (n = 30) de M. marinum. (A) a média micobacteriana cargas foram medidas por qPCR em 2, 4 e 7 semanas pós infecção (wpi) (n = 10) * P < 0,05. (B) os peixes foram sacrificados após o desenvolvimento dos sintomas da doença e sobrevivência parcelas foram criadas. (C). os níveis de expressão de il4 foram medidos no wpi 4. (D) a expressão níveis de relato foram medidos no wpi 4. (A e B) modificado de Parikka et al 201219. (C e D) Modificado de Hammarén et al . 201438. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gene Sequência da primeira demão Temperatura do recozimento
MMITS1 F: CACCACGAGAAACACTCCAA 65
16 – 23SITS Locus AB548718 para quantificação de M. marinum R: ACATCCCGAAACCAACAGAG
loopern4 F: TGAGCTGAAACTTTACAGACACAT 61
Expresso de elementos repetitivos R: AGACTTTGGTGTCTCCAGAATG
il4 GCAGGAATGGCTTTGAAGGG 59.5
ZDB-GENE-100204-1 GCAGTTTCCAGTCCCGGTAT
ifnγ1-2 F: GGGCGATCAAGGAAAACGACCC, 61
ZDB-GENE-040629-1 R: TAGCCTGCCGTCTCTTGCGT

Tabela 1: Primer sequências e altas temperaturas do recozimento. As sequências dos primers utilizados e suas temperaturas de recozimento otimizadas. Os primers para a transcrição de RNA ribossomal 16S-23S M. marinum foram otimizados para um kit de qPCR n-ROX e os outros primers para um ROX incluindo kit de qPCR.

Passo Tempo Temperatura
1 3 min 95 ° C
2 5 s 95 ° C
3 10 s 65 ° C
4 5 s 72 ° C (deteção de fluorescência)
5 Vá para a etapa 2. 39 vezes
6 Análise da curva 55-95° C a derreter com intervalos de 0,5 ° C
7 Para sempre 4 ° C

Tabela 2: programa de qPCR para medição de M. marinum DNA. Um protocolo de qPCR projetado de acordo com as instruções do fabricante e otimizado para medição M. marinum DNA das amostras do zebrafish.

Tempo Temperatura
5 min 25 ° C
30 min 42 ° C
5 min 85 ° C
para sempre 4 ° C

Tabela 3: programa de síntese do cDNA. Protocolo para a síntese do cDNA de RNA extraído de um zebrafish infectado de acordo com as instruções do fabricante.

Passo Tempo Temperatura
1 30 s 95 ° C
2 12 s 95 ° C
3 30 s Recozimento ° C
4 Vá para a etapa 2. por 39 vezes
5 Análise da curva 65-95 ° C a derreter com intervalos de 0,5 ° C
6 Para sempre 4 ° C

Tabela 4: programa de qPCR para medir a expressão do gene do host. Um protocolo de qPCR projetado de acordo com as instruções do fabricante e otimizado para medir a expressão de genes diferentes do zebrafish.

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Discussion

Aqui nós descrevemos uma aplicação baseada em qPCR para medir micobacterianas cargas de DNA extraído de tecidos de zebrafish adultos infectados experimentalmente. Este aplicativo é baseado em cartilhas projetadas em torno do 16S-23S rRNA espaçador transcrito interno sequência40. A carga total de micobactérias em uma amostra de peixes é estimada usando uma curva padrão preparada a partir de DNA extraído de um número conhecido de micobactérias culturas e assumindo que uma bactéria tem uma cópia do seu genoma em qualquer momento dado. Limite de detecção da M. marinum -qPCR é aproximadamente 100 formadoras de unidades18. Uma clara vantagem do método comparado com chapeamento tradicional é que ativo e não dividindo bactérias latentes podem ser detectadas. Além disso, um problema comum de crescimento contaminante em placas de cultura de tecidos de zebrafish é contornado por esta abordagem. No entanto, como o DNA é usado como o modelo, é possível que alguns dos exemplares medidos podem ser derivadas de DNA de bactérias que morreram recentemente. Uma vantagem significativa do protocolo baseado em ácidos nucleicos é que, como o DNA e RNA (tanto proteínas, não descritas aqui) podem ser extraídas do mesmo indivíduo, a carga por micobactérias do indivíduo pode ser combinada com dados da expressão do gene de ambos os host e as bactérias.

A dosagem de M. marinum é um determinante crítico do resultado da infecção. A baixa M. marinum (~ 20-90 CFU) dose de infecção produz um espectro de doenças com latência como a forma mais comum. Se a dose de infecção é na ordem dos milhares, uma doença progressiva mais se desenvolve na maioria dos indivíduos. Como a dose infecciosa natural é conhecida por ser baixa na tuberculose humana41, usar uma dose baixa de M. marinum no modelo de zebrafish é susceptível de produzir uma infecção mais natural. Para atingir a dose correta, certifique-se de validar a relação entre o OD600 e unidades formadoras de colônia, antes de iniciar quaisquer experiências. A variação normal das doses chapeado de infecção é de aproximadamente 30% e não é considerada um problema. No entanto, é importante verificar que o volume inteiro 5 µ l da suspensão bacteriana permanece dentro do peixe. Vazamento da solução de injeção fará com que a variação extra da dose de infecção. Além da dose de infecção, a estirpe da bactéria pode afetar a progressão da doença. Tem sido demonstrado que a virulência da diferentes de M. marinum cepas podem alterar entre as cepas. As duas variedades mais comumente usadas são ATCC927 (isoladas estirpes utilizadas nestas experiências de peixe) e a cepa de M. No entanto, estas variedades diferem grandemente em sua virulência. A cepa de M isolado de humano desenvolve uma doença progressiva mais Considerando que a cepa isolada de peixes produz uma doença mais suave bem-apropriado para estudar a forma latente do infecção micobacteriana33. A virulência da bactéria dentro de uma tensão também pode alterar se a bactéria é serialmente transferido de uma cultura para outra, que podem ser evitadas tomando micobactérias frescas de um congelador estoque com bastante frequência.

In vitro , cultivo de dividir lentamente M. marinum sem antibióticos é propenso a contaminações. Portanto, a manipulação da bactéria requer rigorosa abordagem asséptica realizada em uma capa de fluxo laminar. Possível contaminação da cultura pode ser detectada como muito alto OD600 valor, aparência estranha suspensão bacteriana ou colônias. Colônias de M. marinum são normalmente difusa gumes, plano e matt branco na cor. Culturas de M. marinum são sensíveis à luz e começam a produzir pigmento amarelo quando exposto à luz. Este pigmento amarelo pode ser usado para distinguir M. marinum colônias de outras bactérias após as infecções. Contaminantes podem causar o peixe morrer logo após a infecção. Geralmente, os primeiros sintomas de uma infecção de baixa dose não aparecem antes de 3 semanas pós infecção e nenhuma mortalidade antes neste ponto do tempo é provavelmente devido a contaminação na suspensão bacteriana ou trauma induzido durante a injeção.

Zebrafish adulto são muito sensível ao éster de ácido etil 3-aminobenzoico e não sobrevivem se o tempo de exposição é muito longo ou a concentração de anestésico é muito alta. Portanto, quando infectar, o zebrafish deve ser exposto ao anestésico somente para o mínimo de tempo para se conseguir boa anestesia (~ 1-2 min). Após a infecção, zebrafish adulto são mantidos em grupos, a temperatura de água de 26 e 28 ° C. Se a temperatura for maior ou menor do que isso, pode afetar a taxa de crescimento de M. marinum e cinética da infecção. Além disso, a qualidade de água do tanque (qualidade microbiológica, concentração de sal, pH, saturação de oxigênio) é uma parte importante, garantindo uma experiência bem sucedida. Monitoramento da integridade do peixe precisa ser realizado diariamente e peixes que mostram sintomas de infecção precisam ser removido do grupo e eutanásia. Se o peixe morrer no tanque, os outros peixes podem tornar-se re-infectados através do intestino, o que afetará a progressão da infecção.

O modelo de zebrafish comumente usados larval de tuberculose é aplicável a imunidade inata de estudo, que direciona as experiências para um subconjunto limitado de interações do anfitrião-micróbio. O uso de zebrafish adulto torna possível estudar respostas de imune inatas e adaptativas em um modelo versátil18,32,39. Zebrafish adulto apresenta-se como um modelo de vertebrados conveniente para estudar todo o espectro de tuberculose. Com uma baixa dose de exposição de M. marinum, 7% da população de peixes desenvolver doença progressiva primária, 10% são capazes de esterilizar a infecção, 65% desenvolvem a doença latente e em 18% reativação espontânea ocorre (Figura 2). O espectro de doença se assemelha que vi na tuberculose humana, em que a grande maioria desenvolve uma doença latente, aproximadamente 4-14% produzem infecção ativa primária dentro dos primeiros cinco anos após a infecção42, 10-20% de fortemente pessoas expostas parecem ser capaz de esterilizar a infecção43 e44reativá-5 – 10% das infecções latentes. Diferenças na genética dos anfitriões afeta a susceptibilidade à tuberculose e a progressão de doença45. Isto também é visto na população de zebrafish é geneticamente muito heterogênea, ao contrário de muitos outros laboratório animais46,47. A variação genética natural torna um modelo altamente aplicável na busca de ideais respostas imunes nesta doença multifatorial.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo finlandês Cultural Foundation (H.L.), Fundação de tuberculose de Tampere (H.L., L.-M.V., M.M.H, M.P.), Fundação da associação finlandesa de antituberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (H.L., M.M.H, M.P.), Sigrid Jusélius Foundation (P.F.), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H), Jane e Aatos Erkko Foundation (P.F.) e Academia da Finlândia (P.F.). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo e Jenna Ilomäki são reconhecidos por sua assistência técnica. Os autores reconhecem o laboratório de Zebrafish de Tampere para seu serviço.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mycobacterium marinum American Type Culture Collection ATCC 927
Middlebrock 7H10 agar BD, Thermo Fisher Scientific 11799042
Middlebrock OADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Middlebrock 7H9 medium BD, Thermo Fisher Scientific 11753473
Middlebrock ADC enrichment BD, Thermo Fisher Scientific 11718173
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ML
GENESYS20 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Sigma-Aldrich P4417-50TAB
Phenol red Sigma-Aldrich P3532
27 G needle Henke Sass Wolf 4710004020
1 mL syringe Henke Sass Wolf 4010.200V0
Omnican 100 30 G insulin needle Braun 9151133
3-aminobenzoic acid ethyl ester (pH 7.0) Sigma-Aldrich A5040
1.5 mL homogenization tube Qiagen 13119-1000
2.8 mm ceramic beads Qiagen 13114-325
Ethanol, ETAX Aa Altia
2-propanol Sigma-Aldrich 278475
Chloroform VWR 22711.290
Guanidine thiocyanate Sigma-Aldrich G9277 FW 118.2 g/mol
Sodium citrate Sigma-Aldrich 1613859 FW 294.1 g/mol
Tris (free base) Sigma-Aldrich TRIS-RO FW 121.14 g/mol
TRI reagent Molecular Research Center TR118 Guanidine thiocyanate-phenol solution
PowerLyzer24 homogenizator Qiagen
Sonicator m08 Finnsonic
Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific
SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix Bioline BIO-98005
qPCR 96-well plate BioRad HSP9601
Optically transparent film BioRad MSB1001
C1000 Thermal cycler with CFX96 real-time system BioRad
RNase AWAY Thermo Fisher Scientific 10666421 decontamination reagent eliminating RNases
DNase I Thermo Fisher Scientific EN0525
Reverse Transcription Master Mix Fluidigm 100-6298
SsoFast Eva Green master mix BioRad 172-5211

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Luukinen, H., Hammarén, M. M., Vanha-aho, L. M., Parikka, M. Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (140), e58299, doi:10.3791/58299 (2018).

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