Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Niere Kortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel um die native Niere extrazelluläre Matrix (ECM) strukturelle und biochemische Zusammensetzung behalten zu fabrizieren. Den Fertigungsprozess und ihre Anwendungen werden beschrieben. Schließlich ist eine Perspektive auf die Verwendung dieses Hydrogel zur Niere-spezifische zelluläre und Geweberegeneration und Bioingenieurwissenschaften Unterstützung diskutiert.
Abstract
Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Aktuelle synthetischen Hydrogelen bieten robuste mechanische Unterstützung für in-Vitro Zellkultur aber fehlen die notwendigen Protein und Liganden Zusammensetzung physiologischen Verhalten von Zellen zu entlocken. Dieses Manuskript beschreibt ein Herstellungsverfahren für eine Niere Kortex ECM-abgeleitete Hydrogel mit richtige mechanische Robustheit und unterstützende biochemischen Zusammensetzung. Das Hydrogel ist von mechanisch Homogenisieren und Gefäss-decellularized menschliche Niere Kortex ECM hergestellt. Die Matrix bewahrt native Niere Kortex ECM Protein Verhältnisse Gelierung zu physiologischen mechanische Steifigkeit ermöglicht. Das Hydrogel dient als Substrat auf die Nieren Rinde gewonnenen Zellen unter physiologischen Bedingungen aufrechterhalten werden können. Darüber hinaus kann die Hydrogel-Zusammensetzung manipuliert werden, um eine kranke Umwelt-Modell ermöglicht die Zukunftsstudie von Nierenerkrankungen.
Introduction
Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Die komplexen molekularen Zusammensetzung regelt die strukturelle und funktionelle Eigenschaften des Gewebes. Strukturproteine Zellen mit räumliches Vorstellungsvermögen und Adhäsion und Migration1. Gebundene Liganden interagieren mit Oberfläche Zellrezeptoren, Zelle Verhalten2zu kontrollieren. Niere ECM enthält eine Fülle von Molekülen, deren Zusammensetzung und Struktur variiert je nach anatomischen Lage, Entwicklungsstufe und Krankheit Staat3,4. Rekapitulation der Komplexität von ECM ist ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung der Nieren-abgeleitete Zellen in Vitro.
Frühere Versuche zur Replikation von ECM Mikroumgebungen konzentrierten sich auf einem ganzen Gewebe, Gerüste Recellularization zusammenzustellen. Decellularization mit chemischen Reinigungsmitteln wie Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) oder nichtionischen Reinigungsmitteln durchgeführt wurde, und es nutzt entweder ganze Organ Perfusion oder Eintauchen und Agitation Methoden5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. Die hier vorgestellten Gerüste bewahren die strukturelle und biochemische Signale in nativen Gewebe ECM gefunden; Darüber hinaus Recellularization mit Spender-spezifischen Zellen hat klinischen Relevanz in der rekonstruktiven Chirurgie14,15,16,17,18, 19. allerdings diese Gerüste fehlen strukturelle Flexibilität und sind daher nicht kompatibel mit vielen aktuellen Geräten für in-vitro- Studien verwendet. Um diese Einschränkung zu umgehen, haben viele Gruppen decellularized ECM zu Hydrogele20,21,22,23,24weiterverarbeitet. Diese Hydrogele sind kompatibel mit Spritzguss und Bioink und Mikrometer Skala räumliche Einschränkungen, die Gerüste auf Zellen statt decellularized umgehen. Darüber hinaus sind Molekulare Zusammensetzung und Verhältnisse in native ECM gefunden3,25erhalten. Hier zeigen wir eine Methode, um ein Hydrogel, abgeleitet von Niere Kortex ECM (kECM) herzustellen.
Dieses Protokoll soll ein Hydrogel zu produzieren, die die Mikroumgebung der Niere kortikalen Region repliziert werden. Nierengewebe Kortex ist in einer 1 % SDS-Lösung unter ständiger Bewegung, zelluläre Materie zu entfernen decellularized. SDS ist häufig verwendet, um Gewebe wegen seiner Fähigkeit, schnell zu entfernen, immunologische zellulären Material6,7,9,26decellularize. Dann unterliegt die kECM mechanische Homogenisierung und Lyophilisation5,6,9,11,26. Solubilisierung in einer starken Säure mit Pepsin führt zu einer endgültigen Hydrogel-Stammlösung20,27. Native kECM Proteine, die wichtig sind für strukturelle Unterstützung und signal-Transduktion sind3,25erhalten. Das Hydrogel kann auch in einer Größenordnung von nativen menschlichen Niere Kortex28,29,30, geliert werden. Diese Matrix bietet eine physiologische Umgebung, die verwendet wurde, um die Ruhe der Niere-spezifischen Zellen im Vergleich zu Hydrogele aus anderen matrixproteine pflegen. Darüber hinaus Matrix Zusammensetzung manipuliert werden kann, zum Beispiel durch die Zugabe von Kollagen-I Modell Krankheit Umgebungen für die Studie der renalen Fibrose und andere Niere Krankheiten31,32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Matrizen liefern wichtige mechanische und chemische Signale, die Zelle Verhalten steuern. Synthetische Hydrogele sind in der Lage, komplexe 3-dimensionale Musterung unterstützen, aber nicht die vielfältigen extrazelluläre Signale in physiologischen Matrix Mikroumgebungen gefunden. Hydrogele native ECM abgeleitet sind ideale Materialien für in Vivo und in Vitro Studien. Frühere Studien haben decellularized ECM Hydrogele verwendet, um synthetische Biomaterialien zur Vermeidung Host Immunreaktionen<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Lynn und Mike Garvey Imaging Laboratory am Institut für Stammzellen und Regenerationsmedizin und LifeCenter Nordwesten anzuerkennen. Sie möchten auch die finanzielle Unterstützung der National Institutes of Health Zuschüsse, UH2/UH3 TR000504 (, j.h.) und DP2DK102258 (um Y.Z), NIH T32 Ausbildung Grant DK0007467 (R.J.N.), und ein uneingeschränkter Geschenk aus Nordwesten Niere Zentren zu erkennen an der Niere-Forschungsinstitut.
Materials
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
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