כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדות של הכליה קורטקס חוץ-תאית מטריקס-derived הידרוג כדי לשמור על הכליה יליד מטריצה חוץ-תאית (ECM) הרכב הביוכימי מבניים. תהליך ייצור ויישומיה מתוארים. לבסוף, נדון פרספקטיבה על שימוש זה הידרוג לתמיכה ספציפית כליות הסלולר ורקמות רגנרציה ומחזור בביו-הנדסה.
מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים biophysical וביוכימי חשוב כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. Hydrogels סינתטי הנוכחי מציעים תמיכה מכנית חזקה במבחנה תרבית תאים אך חוסר הרכב צורך חלבון וליגנד שמעודדים התנהגות פיזיולוגית מתאי. כתב יד זה מתאר שיטת ייצור הידרוג נגזר ECM קליפת הכליה עם חוסן מכני תקין והרכב ביוכימי תומכת. הידרוג מפוברק על ידי מכנית homogenizing ו solubilizing decellularized כליה אנושית קליפת ECM. המטריקס משמר כליה יליד קליפת ECM חלבון יחסי תוך גם מתן אפשרות gelation כדי stiffnesses מכני פיזיולוגיים. הידרוג משמש מצע על כליה אילו תאים בקליפת המוח-derived יכול להישמר בתנאים פיזיולוגיים. יתר על כן, ניתן לטפל ההרכב הידרוג לדגם סביבה חולה אשר מאפשר חקר מחלות כליה לעתיד.
מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים biophysical וביוכימי חשוב כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. ההרכב המולקולרי מורכבים מסדיר מאפיינים מבניים והן תפקודית של רקמות. חלבונים מבניים לספק תאים עם מודעות מרחבית ולאפשר הדבקה והעברה1. ליגנדים מאוגד אינטראקציה עם קולטני פני שטח התא כדי לשלוט בהתנהגות התא2. כליות ECM מכיל שפע של מולקולות של מי הרכב ומבנה משתנה בהתאם למיקום האנטומי, שלב התפתחותי מחלות המדינה3,4. Recapitulating את המורכבות של ECM הוא היבט מרכזי בלימוד תאי כליה-derived בתוך חוץ גופית.
ניסיונות קודמים-שכפול ECM microenvironments התמקדו decellularizing כל רקמות כדי ליצור פיגומים מסוגל recellularization. Decellularization בוצעה עם חומרי ניקוי כימיים כגון נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) או בדטרגנטים ללא יונית, הוא מנצל גם כל האיבר זלוף או טבילה ועצבנות שיטות5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. פיגומים המובאת כאן לשמר את המקלות הביוכימי מבניים נמצא ברקמת יליד ECM; יתר על כן, recellularization עם תאי התורם ספציפי יש הרלוונטיות הקלינית ניתוח שיחזור14,15,16,17,18, 19. עם זאת, אלה פיגומים חוסר גמישות מבנית, ולכן הם תואם התקנים רבים הנוכחי המשמש עבור מחקרים במבחנה . כדי להתגבר על מגבלה זו, קבוצות רבות יש עיבוד נוסף decellularized ECM לתוך hydrogels20,21,22,23,24. Hydrogels אלה עולים בקנה אחד עם הזרקת פלסטיק, bioink, לעקוף מיקרומטר סולם באילוצים המרחבי decellularized המקום פיגומים על תאים. יתר על כן, ההרכב המולקולרי של יחסי נמצאו ב- ECM יליד נשמרים3,25. כאן נדגים שיטה כדי לבדות של הידרוג שמקורם קליפת הכלייה ECM (kECM).
המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר הידרוג משכפל את microenvironment של האזור קורטיקלית בכליה. רקמת קליפת הכלייה הוא decellularized בפתרון מרחביות 1% תחת עצבנות מתמדת כדי להסיר חומר הסלולר. מרחביות משמש בדרך כלל כדי decellularize רקמות בשל היכולת להסיר במהירות חיסוניות תאית גשמי6,–7,–9,–26. KECM מכן כפוף המגון מכני ו- lyophilization5,6,9,11,26. Solubilization ב חומצה חזקה עם פפסין תוצאות20,מניות פתרון הסופי הידרוג27. יליד kECM חלבונים חשובים מבני תמיכה, האות התמרה חושית נשמרים3,25. הידרוג יכול גם להיות הג’לי כדי בתוך סדר גודל אחד של כליה אנושית יליד קליפת28,29,30. מטריצה זו מספק סביבה פיזיולוגיים שבו נעשה שימוש כדי לשמור את תרדמה של תאים ספציפיים הכליה בהשוואה hydrogels של חלבונים אחרים מטריקס. יתר על כן, מטריקס הרכב יכול להיות מתומרן, לדוגמה, באמצעות התוספת של קולגן-אני, מודל המחלה סביבות לצורך המחקר של פיברוזיס כליות ו31,אחרים מחלות כליה32.
מטריצות מספקים רמזים חשובים מכאני וכימי המפקחים בהתנהגות התא. Hydrogels סינתטי מסוגלים לתמוך המתבנת תלת-ממדי מורכב אך נכשלים לספק את רמזים חוץ-תאית מגוונים שנמצאו microenvironments פיזיולוגי במטריקס. Hydrogels נגזר ECM מקורית הן בחומרים אידיאלי ללימודי הן vivo והן במבחנה . מחקרים קודמים השתמשו decellul…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצה להכיר את לין ואת מייק גארווי הדמיה מעבדה במכון תאי גזע של רפואה רגנרטיבית ו LifeCenter. הם רוצים גם לקבל סיוע כספי של מכוני הבריאות הלאומיים מענקים, TR000504 UH2/UH3 (כדי ג’יי-אייץ) ו DP2DK102258 (ל Y.Z.), מענק הכשרה NIH T32 DK0007467 (ל R.J.N.) מתנה בלתי מוגבלת ממרכזי כליות מערב מכון המחקר כליות.
Preparation of Kidney Tissue | |||
5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
Fabrication of ECM Gel | |||
Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
Kidney ECM Gelation | |||
1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |