בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדות של הכליה קורטקס חוץ-תאית מטריקס-derived הידרוג כדי לשמור על הכליה יליד מטריצה חוץ-תאית (ECM) הרכב הביוכימי מבניים. תהליך ייצור ויישומיה מתוארים. לבסוף, נדון פרספקטיבה על שימוש זה הידרוג לתמיכה ספציפית כליות הסלולר ורקמות רגנרציה ומחזור בביו-הנדסה.
Abstract
מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים biophysical וביוכימי חשוב כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. Hydrogels סינתטי הנוכחי מציעים תמיכה מכנית חזקה במבחנה תרבית תאים אך חוסר הרכב צורך חלבון וליגנד שמעודדים התנהגות פיזיולוגית מתאי. כתב יד זה מתאר שיטת ייצור הידרוג נגזר ECM קליפת הכליה עם חוסן מכני תקין והרכב ביוכימי תומכת. הידרוג מפוברק על ידי מכנית homogenizing ו solubilizing decellularized כליה אנושית קליפת ECM. המטריקס משמר כליה יליד קליפת ECM חלבון יחסי תוך גם מתן אפשרות gelation כדי stiffnesses מכני פיזיולוגיים. הידרוג משמש מצע על כליה אילו תאים בקליפת המוח-derived יכול להישמר בתנאים פיזיולוגיים. יתר על כן, ניתן לטפל ההרכב הידרוג לדגם סביבה חולה אשר מאפשר חקר מחלות כליה לעתיד.
Introduction
מטריצה חוץ-תאית (ECM) מספק רמזים biophysical וביוכימי חשוב כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. ההרכב המולקולרי מורכבים מסדיר מאפיינים מבניים והן תפקודית של רקמות. חלבונים מבניים לספק תאים עם מודעות מרחבית ולאפשר הדבקה והעברה1. ליגנדים מאוגד אינטראקציה עם קולטני פני שטח התא כדי לשלוט בהתנהגות התא2. כליות ECM מכיל שפע של מולקולות של מי הרכב ומבנה משתנה בהתאם למיקום האנטומי, שלב התפתחותי מחלות המדינה3,4. Recapitulating את המורכבות של ECM הוא היבט מרכזי בלימוד תאי כליה-derived בתוך חוץ גופית.
ניסיונות קודמים-שכפול ECM microenvironments התמקדו decellularizing כל רקמות כדי ליצור פיגומים מסוגל recellularization. Decellularization בוצעה עם חומרי ניקוי כימיים כגון נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) או בדטרגנטים ללא יונית, הוא מנצל גם כל האיבר זלוף או טבילה ועצבנות שיטות5,6,7 ,8,9,10,11,12,13. פיגומים המובאת כאן לשמר את המקלות הביוכימי מבניים נמצא ברקמת יליד ECM; יתר על כן, recellularization עם תאי התורם ספציפי יש הרלוונטיות הקלינית ניתוח שיחזור14,15,16,17,18, 19. עם זאת, אלה פיגומים חוסר גמישות מבנית, ולכן הם תואם התקנים רבים הנוכחי המשמש עבור מחקרים במבחנה . כדי להתגבר על מגבלה זו, קבוצות רבות יש עיבוד נוסף decellularized ECM לתוך hydrogels20,21,22,23,24. Hydrogels אלה עולים בקנה אחד עם הזרקת פלסטיק, bioink, לעקוף מיקרומטר סולם באילוצים המרחבי decellularized המקום פיגומים על תאים. יתר על כן, ההרכב המולקולרי של יחסי נמצאו ב- ECM יליד נשמרים3,25. כאן נדגים שיטה כדי לבדות של הידרוג שמקורם קליפת הכלייה ECM (kECM).
המטרה של פרוטוקול זה היא לייצר הידרוג משכפל את microenvironment של האזור קורטיקלית בכליה. רקמת קליפת הכלייה הוא decellularized בפתרון מרחביות 1% תחת עצבנות מתמדת כדי להסיר חומר הסלולר. מרחביות משמש בדרך כלל כדי decellularize רקמות בשל היכולת להסיר במהירות חיסוניות תאית גשמי6,–7,–9,–26. KECM מכן כפוף המגון מכני ו- lyophilization5,6,9,11,26. Solubilization ב חומצה חזקה עם פפסין תוצאות20,מניות פתרון הסופי הידרוג27. יליד kECM חלבונים חשובים מבני תמיכה, האות התמרה חושית נשמרים3,25. הידרוג יכול גם להיות הג’לי כדי בתוך סדר גודל אחד של כליה אנושית יליד קליפת28,29,30. מטריצה זו מספק סביבה פיזיולוגיים שבו נעשה שימוש כדי לשמור את תרדמה של תאים ספציפיים הכליה בהשוואה hydrogels של חלבונים אחרים מטריקס. יתר על כן, מטריקס הרכב יכול להיות מתומרן, לדוגמה, באמצעות התוספת של קולגן-אני, מודל המחלה סביבות לצורך המחקר של פיברוזיס כליות ו31,אחרים מחלות כליה32.
Protocol
Representative Results
Discussion
מטריצות מספקים רמזים חשובים מכאני וכימי המפקחים בהתנהגות התא. Hydrogels סינתטי מסוגלים לתמוך המתבנת תלת-ממדי מורכב אך נכשלים לספק את רמזים חוץ-תאית מגוונים שנמצאו microenvironments פיזיולוגי במטריקס. Hydrogels נגזר ECM מקורית הן בחומרים אידיאלי ללימודי הן vivo והן במבחנה . מחקרים קודמים השתמשו decellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להכיר את לין ואת מייק גארווי הדמיה מעבדה במכון תאי גזע של רפואה רגנרטיבית ו LifeCenter. הם רוצים גם לקבל סיוע כספי של מכוני הבריאות הלאומיים מענקים, TR000504 UH2/UH3 (כדי ג’יי-אייץ) ו DP2DK102258 (ל Y.Z.), מענק הכשרה NIH T32 DK0007467 (ל R.J.N.) מתנה בלתי מוגבלת ממרכזי כליות מערב מכון המחקר כליות.
Materials
| Preparation of Kidney Tissue | |||
| 5000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| Sterile H2O | Autoclaved DI H2O | ||
| Stir Bar (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vacuum Filter | VWR | 97066-202 | |
| Stir Plate | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Beaker | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4642 | Any similar forceps may be used |
| Scissor-Handle Hemostat Clamp | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Dissecting Scissors | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Scalpel Handle, No. 4 | VWR | 25859-000 | Any similar scalpel handle may be used |
| Scalpel Blade, No. 20 | VWR | 25860-020 | Any similar scalpel blade may be used |
| Stir Bar (38.1 x 9.5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Absorbent Underpad | VWR | 82020-845 | |
| Petri Dish (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoclavable Biohazard Bag | VWR | 14220-026 | |
| Sterile Cell Strainer (40 um) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Cell Culture Grade Water | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freestanding Tube | VWR | 89012-778 | |
| Fabrication of ECM Gel | |||
| Tissue Homogenizer Machine | Polytron | PCU-20110 | |
| Freeze Dryer | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glass Scintillation Vials and Cap | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Stir Bar (15.9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0.01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water |
| Kidney ECM Gelation | |||
| 1 N NaOH (Sterile) | Sigma-Aldrich | 415413 | Dilute to 1 N in cell culture grade water |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Conical Tube | ThermoFisher | 339651 | |
| Cell Culture Media | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Syringe | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Microspatula | Sigma-Aldrich | Z193208 |
References
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney International. 56 (6), 2016-2024 (1999).
- Petrosyan, A., et al. Decellularized Renal Matrix and Regenerative Medicine of the Kidney: A Different Point of View. Tissue Engineering Part B. 22 (3), 183-192 (2016).
- Caralt, M., et al. Optimization and Critical Evaluation of Decellularization Strategies to Develop Renal Extracellular Matrix Scaffolds as Biological Templates for Organ Engineering and Transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (1), 64-75 (2015).
- Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2207-2216 (2010).
- Nakayama, K. H., Lee, C. C. I., Batchelder, C. A., Tarantal, A. F. Tissue Specificity of Decellularized Rhesus Monkey Kidney and Lung Scaffolds. Public Library of Science ONE. 8 (5), (2013).
- Orlando, G., et al. Production and implantation of renal extracellular matrix scaffolds from porcine kidneys as a platform for renal bioengineering investigations. Annals of Surgery. 256 (2), 363-370 (2012).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choi, S. H., et al. Development of a porcine renal extracellular matrix scaffold as a platform for kidney regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (4), 1391-1403 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
- Nagao, R. J., et al. Decellularized Human Kidney Cortex Hydrogels Enhance Kidney Microvascular Endothelial Cell Maturation and Quiescence. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1140-1150 (2016).
- Gupta, S. K., Mishra, N. C., Dhasmana, A. Decellularization Methods for Scaffold Fabrication. Methods in Molecular Biology. , 1-10 (2017).
- Hudson, T., et al. Optimized Acellular Nerve Graft is Immunologically Tolerated and Supports Regeneration. Tissue Engineering. 10 (11), 1641-1651 (2004).
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularied liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16 (7), 814-820 (2010).
- Nagao, R. J., et al. Preservation of Capillary-beds in Rat Lung Tissue Using Optimized Chemical Decellularization. Journal of Materials Chemistry B. 1 (37), 4801-4808 (2013).
- Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Medicine. 19 (5), 646-651 (2013).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Wolf, M. T., et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix. Biomaterials. 33 (29), 7028-7038 (2012).
- Fisher, M. B., et al. Potential of healing a transected anterior cruciate ligament with genetically modified extracellular matrix bioscaffolds in a goat model. Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy. 20 (7), 1357-1365 (2012).
- Ghuman, H., et al. ECM hydrogel for the treatment of stroke: Characterization of the host cell infiltrate. Biomaterials. 91, 166-181 (2016).
- Rijal, G. The decellularized extracellular matrix in regenerative medicine. Regenerative Medicine. 12 (5), 475-477 (2017).
- Lennon, R., et al. Global Analysis Reveals the Complexity of the Human Glomerular Extracellular Matrix. Journal of the American Society of Nephrology. 25 (5), 939-951 (2014).
- Bonandrini, B., et al. Recellularization of Well-Preserved Acellular Kidney Scaffold Using Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1486-1498 (2014).
- O’Neill, J. D., Freytes, D. O., Anandappa, A. J., Oliver, J. A., Vunjak-Novakovic, G. V. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney. Biomaterials. 34 (38), 9830-9841 (2013).
- Streitberger, K. -. J., et al. High-resolution mechanical imaging of the kidney. Journal of Biomechanics. 47 (3), 639-644 (2014).
- Bensamoun, S. F., et al. Stiffness imaging of the kidney and adjacent abdominal tissues measured simultaneously using magnetic resonance elastography. Clinical Imaging. 35 (4), 284-287 (2011).
- Moon, S. K., et al. Quantification of Kidney Fibrosis Using Ultrasonic Shear Wave Elastography. Journal of Ultrasound in Medicine. 34, 869-877 (2015).
- Genovese, F., Manresa, A. A., Leeming, D. J., Karsdal, M. A., Boor, P. The extracellular matrix in the kidney: a source of novel non-invasive biomarkers of kidney fibrosis?. Fibrogenesis & Tissue Repair. 7 (1), (2014).
- Hewitson, T. D. Fibrosis in the kidney: is a problem shared a problem halved?. Fibrogenes & Tissue Repair. 5 (1), S14 (2012).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Faulk, D. M., et al. ECM hydrogel coating mitigates the chronic inflammatory response to polypropylene mesh. Biomaterials. 35 (30), 8585-8595 (2014).
- Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels To Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
- Kim, M. -. S., et al. Differential Expression of Extracellular Matrix and Adhesion Molecules in Fetal-Origin Amniotic Epithelial Cells of Preeclamptic Pregnancy. Public Library of Science ONE. 11 (5), e0156038 (2016).
- Paduano, F., Marrelli, M., White, L. J., Shakesheff, K. M., Tatullo, M. Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells on Hydrogel Scaffolds Derived from Decellularized Bone Extracellular Matrix and Collagen Type I. Public Library of Science ONE. 11 (2), e0148225 (2016).
- Viswanath, A., et al. Extracellular matrix-derived hydrogels for dental stem cell delivery. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (1), 319-328 (2017).
- Uriel, S., et al. Extraction and Assembly of Tissue-Derived Gels for Cell Culture and Tissue Engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 15 (3), 309-321 (2009).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Faust, A., et al. Urinary bladder extracellular matrix hydrogels and matrix-bound vesicles differentially regulate central nervous system neuron viability and axon growth and branching. Journal of Biomaterials Applications. 31 (9), 1277-1295 (2017).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nature Communications. 5, 3935 (2014).
- Pati, F., et al. Biomimetic 3D tissue printing for soft tissue regeneration. Biomaterials. 62, 164-175 (2015).
- Wang, R. M., Christman, K. L. Decellularized myocardial matrix hydrogels: In basic research and preclinical studies. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 77-82 (2016).
- Jang, J., et al. 3D printed complex tissue construct using stem cell-laden decellularized extracellular matrix bioinks for cardiac repair. Biomaterials. 112, 264-274 (2017).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Mouw, J. K., Ou, G., Weaver, V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 771-785 (2014).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials – Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Uriel, S., et al. The role of adipose protein derived hydrogels in adipogenesis. Biomaterials. 29 (27), 3712-3719 (2008).
- Singelyn, J. M., et al. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
- Loneker, A. E., Faulk, D. M., Hussey, G. S., D’Amore, A., Badylak, S. F. Solubilized liver extracellular matrix maintains primary rat hepatocyte phenotype in-vitro. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (4), 957-965 (2016).
- Hill, R. C., Calle, E. A., Dzieciatkowska, M., Niklason, L. E., Hansen, K. C. Quantification of extracellular matrix proteins from a rat lung scaffold to provide a molecular readout for tissue engineering. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 961-973 (2015).
- Li, Q., et al. Proteomic analysis of naturally-sourced biological scaffolds. Biomaterials. 75, 37-46 (2016).
- Tanaka, T., Yada, R. Y. N-terminal portion acts as an initiator of the inactivation of pepsin at neutral pH. Protein Engineering. 14 (9), 669-674 (2001).
- Ligresti, G., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (8), 2370-2381 (2016).
- Mozes, M. M., Böttinger, E. P., Jacot, T. A., Kopp, J. B. Renal expression of fibrotic matrix proteins and of transforming growth factor-beta (TGF-beta) isoforms in TGF-beta transgenic mice. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (2), 271-280 (1999).
- Romanowicz, L., Galewska, Z. Extracellular matrix remodeling of the umbilical cord in pre-eclampsia as a risk factor for fetal hypertension. Journal of Pregnancy. 2011, 542695 (2011).
