ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת
Summary
כאן אנו מציגים מדריך מעשי של בניית מערכת משולבת מיקרוסקופ, אשר ממזג הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי הדמיה המבוססת על זיהוי סופר-ברזולוציה מולקולה בודדת, גילוי מולקולה בודדת צבע רב, כולל מולקולה בודדת פלורסצנטיות תהודה העברת האנרגיה הדמיה, לתוך הגדרת אחד באופן יעיל.
Abstract
קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות מולקולות ביולוגיות בחיי עיר ולנטר את הדינמיקה ואת אינטראקציות בזמן אמת. בנוסף מיקרוסקופ אפינפרין קונבנציונלי-זריחה, פותחו טכניקות הדמיה שונות כדי להשיג את מטרותיה ניסיוני. כמה הטכניקות בשימוש נרחב כוללים קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת תהודה העברת אנרגיה (smFRET), אשר יכול לדווח על שינויים הסתגלותי ואינטראקציות מולקולרית עם רזולוציה אנגסטרום, המבוססת על זיהוי מולקולה בודדת סופר רזולוציה (SR) הדמיה, אשר יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית כ עשר כדי twentyfold בהשוואה מיקרוסקופ עקיפה-מוגבלת. כאן אנו מציגים מעוצבת ללקוח משולב מערכת, אשר ממזג שיטות הדמיה מרובות במיקרוסקופ אחד, כולל הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה של צבע רב גילוי מולקולה בודדת, כולל הדמיה smFRET. שיטות הדמיה שונות ניתן להשיג בקלות, reproducibly על ידי החלפת רכיבים אופטיים. זה קל לאמץ על ידי כל מעבדה למחקר במדעי הביולוגיה עם צורך השגרה וניסויים הדמיה מגוונות עלות מופחתת וחלל ביחס בניין נפרד מיקרוסקופים לצורכי הפרט.
Introduction
קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופים כלים חשובים למחקר במדעי הביולוגיה המודרנית, הדמיה פלורסנט מתבצע באופן שגרתי על מעבדות ביולוגיה רבות. על-ידי תיוג מולקולות של עניין עם fluorophores, אנו יכולים ישירות לדמיין אותם תחת המיקרוסקופ, לתעד את השינויים תלויי-זמן לוקליזציה, קונפורמציה, אינטראקציה, ואת מכלול המדינה vivo בתוך או במבחנה. קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופים יש רזולוציה מרחבית עקיפה-מוגבלת, אשר ~ 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב ו ~ 500-700 nm, הכיוון צירית1,2, והם, לכן, מוגבל לדימות-שים את הכסף בתיק של סולם ננומטר-כדי-מיקרו. על מנת לחשוף פרטים עדינה הרכבה מולקולרי או הארגון, פותחו microscopies SR שונים שיכולים לשבור את מגבלת עקיפה. אסטרטגיות כדי להשיג SR כוללים אפקטים אופטיים ליניארי, כגון פליטה מאולצת דלדול (STED) מיקרוסקופיה3,4 , תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM)5,6, 7, זיהוי סטוכסטי של מולקולות יחיד, כגון שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)8 ו photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל)9, שילוב של שניהם, כגון MINFLUX10. בין אלה microscopies SR, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR מיקרוסקופים ניתן לשנות בקלות יחסית של מלכודת מיקרוסקופ מולקולה בודדת. עם הפעלת החוזרות על עצמן, הדמיה של חלבונים פלורסנט photoactivatable (FPs) או צבעי תמונה-להחלפה מתויגים על מולקולות של עניין, רזולוציה מרחבית יכולים להגיע nm 10-2011. כדי לקבל מידע על אינטראקציות מולקולרית הסתגלותי נדרש דינאמיקה של רזולוציה בזמן אמת, אנגסטרום-כדי-ננומטר. 12,smFRET13 היא גישה אחת כדי להשיג החלטה זו. באופן כללי, בהתאם השאלות הביולוגי של עניין, נדרשים בשיטות הדמיה עם רזולוציות שונות מרחבית.
בדרך כלל, עבור כל סוג של הדמיה, נדרשת תצורה אופטי מסוים עירור ו/או פליטה. למשל, באחת השיטות הנפוצות ביותר תאורה לגילוי מולקולה בודדת היא באמצעות החזרה גמורה (טיר), שבו זווית עירור ספציפי צריך להיות מושגת דרך פריזמה או דרך העדשה אובייקטיבי. עבור זיהוי smFRET, פליטת התורם והן מקבל צבע צריך להיות מופרדים במרחב ו בוים על חלקים שונים האלקטרון-הכפלת, תשלום מצמידים מכשיר (EMCCD), אשר יכולה להיות מושגת עם סדרה של מראות, מפצלי הקרן ודיקרואיק זוהר ממוקם בנתיב פליטה. עבור תלת-ממדיים (3-D) SR הדמיה, רכיב אופטי, כגון עדשה גלילית14, יש צורך לגרום אפקט אסטיגמציה בנתיב פליטה. לכן, homebuilt או זמינים מסחרית מיקרוסקופים משולב, בדרך כלל, באופן פונקציונלי התמחה עבור כל סוג של הדמיה שיטה, אינם גמישים כדי לעבור בין שיטות הדמיה שונות על הסידור זהה. כאן אנו מציגים מערכת היברידית חסכונית, המספקת מתגים מתכווננת, לשחזור בין שלוש שיטות הדמיה שונות: הדמיה epi-פלורסנט קונבנציונלי עם רזולוציה מוגבלת עקיפה, יחיד מולקולה המבוססת על זיהוי SR הדמיה, זיהוי חד-מולקולה צבע רב, כולל smFRET הדמיה (איור 1 א’). באופן ספציפי, הסידור המובאת כאן מכיל סיבים מצמידים לייזרים קלט של צבע רב עירור, זרוע תאורה מסחרי בנתיב עירור, אשר מאפשר מתוכנת השליטה הזווית עירור, כדי לעבור בין epi-מצב ומצב טיר. בנתיב פליטה, קלטת עדשה גלילית homebuilt נשלף ממוקם בתוך הגוף מיקרוסקופ לדימות SR תלת-ממדי ולאחר במפצל קרן מסחרי ממוקמת לפני מצלמה EMCCD שיכול להפוך לזמין באופן סלקטיבי כדי לזהות ערוצים מרובים פליטה בעת ובעונה אחת.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת מיקרוסקופ היברידית זו מבטלת את הצורך לרכוש מיקרוסקופים מרובים. הסכום הכולל עבור כל החלקים, כולל שולחן אופטי, שולחן העבודה ההתקנה, התוכנה, תחנת עבודה, הוא בערך דולר ועל 230,000 שמו. חלקים במכונה מותאם אישית, כולל עדשה mag, עדשת תלת-ממדי, עולה בסביבות 700 דולר (המחיר תלוי האישום בפועל במוסדות ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ג’יי מאשר תמיכה של התוכנית מלומדים סרל ופרס הבמאי NIH חדש חדשן. המחברים לאשר הצעות שימושיות מהמעבדה של פול Selvin (באוניברסיטה של אילינוי באורבנה-שמפיין) לצורך מיקום העדשה תלת-ממדי.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
