Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken
Summary
Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.
Abstract
Floresans mikroskobu biyolojik moleküller üzerine çalışmaları in situ algılamak ve onların dinamiği ve etkileşim gerçek zamanlı olarak izlemek için güçlü bir araçtır. Geleneksel epi-floresan mikroskopi ek olarak, belirli deneysel hedeflere ulaşmak için çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Bazı yaygın olarak kullanılan teknikler konformasyon değişiklikler ve angstrom çözünürlük ve tek molekül algılama tabanlı moleküler etkileşimleri bildirebilirsiniz tek molekül floresans rezonans enerji transfer (smFRET), dahil uzaysal çözünürlüğü için yaklaşık on twentyfold kırınım-sınırlı Mikroskopi için karşılaştırıldığında artırabilir görüntüleme-Süper çözünürlük (SR). Burada bir mikroskop, geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı SR görüntü ve çok renkli tek molekül algılama dahil olmak üzere birden çok görüntüleme yöntemleri birleştirir bir müşteri tasarlanmış entegre sistemi, mevcut, smFRET görüntüleme dahil olmak üzere. Farklı görüntüleme yöntemleri kolayca ve tekrarlanarak optik öğeleri geçiş yaparak elde edilebilir. Bu kurulum rutin ve düşük maliyet ve bireysel amaçlar için ayrı mikroskoplar bina göre alan çeşitli görüntüleme deneyler için bir ihtiyaç ile Biyoloji Bilimleri herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından evlat edinmek kolaydır.
Introduction
Floresans mikroskoplar modern biyolojik bilim araştırma için önemli araçlar ve floresan görüntüleme düzenli olarak birçok biyoloji laboratuvarlarında yapılan. Biomolecules fluorophores ile ilgi etiketleyerek, biz doğrudan onları mikroskop altında görselleştirmek ve yerelleştirme, uyum, etkileşim ve derleme devlet içinde VIVO veya vitrozamana bağımlı değişiklikleri kaydetmek. Geleneksel floresan mikroskoplar ~ 200-300 nm yanal yönde ve ~ 500-700 nm eksenel yönde1,2ve vardır, bu nedenle, düşsel vasıl 100’ler için sınırlı olduğunu bir kırınım-sınırlı kayma çözünürlüğe sahip nanometre mikron ölçek. Moleküler derleme veya kuruluşunuzdaki ince ayrıntıları ortaya çıkarmak için kırınım sınırı zarar verebilir çeşitli SR microscopies geliştirilmiştir. SR elde etmek için kullanılan stratejiler içerir uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi3,4 ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)5,6, gibi doğrusal olmayan optik etkileri 7, Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)8 ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM)9ve MINFLUX10gibi her ikisinin bir birleşimi gibi tek moleküllerin Stokastik algılama. Bu SR microscopies arasında tek molekül algılama tabanlı SR mikroskoplar tek molekül mikroskop set-up nispeten kolayca değiştirilebilir. Tekrarlayan harekete geçirmek ve photoactivatable floresan proteinler (FPs) veya fotoğraf değiştirilebilir boyalar üzerinde ilgi biomolecules öğesini görüntüleme ile Uzaysal Çözünürlük 10-20 nm11ulaşabilirsiniz. Moleküler etkileşimleri ve konformasyon bilgi elde etmek için gerçek zamanlı, angstrom nanometre çözünürlükte dynamics gereklidir. smFRET12,13 bu çözünürlük elde etmek için bir yaklaşımdır. Genel olarak, faiz biyolojik sorular bağlı olarak, görüntüleme yöntemleri farklı uzamsal çözünürlük ile ihtiyaç vardır.
Tipik olarak, görüntüleme her türü için belirli uyarma ve/veya emisyon optik yapılandırmasına gerek yoktur. Örneğin, tek molekül algılama için en sık kullanılan aydınlatma yöntemlerden birini belirli uyarma açı bir prizma veya objektif lens yoluyla ulaşılması gereken toplam iç yansıma (tır), geçer. SmFRET tespiti için donör ve alıcısı boyalar emisyonları dağınık şekilde ayrılmış olup elektron-çarpımı, şarj kuplajlı birtakım aynalar ve dikroik ışın ayırıcılar ile elde edilebilir cihaz (EMCCD), farklı bölümlerine yönelik gerek emisyon yolundaki yerleştirilir. Üç boyutlu (3-D), düşsel bir optik, bir bileşen bir silindirik objektif14, SR emisyon yolundaki bir astigmat etkiye neden için gereklidir. Bu nedenle, homebuilt veya piyasada bulunan entegre mikroskoplar genellikle, işlevsel olarak görüntüleme yöntemi her türü için uzmanlaşmış olan ve aynı kurulum üzerinde farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş yapmak için esnek değildir. Burada üç farklı görüntüleme yöntemleri arasında ayarlanabilir ve tekrarlanabilir anahtarları sağlayan bir maliyet-etkin, hibrid sistemi mevcut: kırınım-sınırlı çözünürlük, tek molekül algılama tabanlı SR ile geleneksel epi-floresan görüntüleme görüntü ve çok renkli tek molekül algılama, smFRET (Şekil 1A) görüntüleme dahil olmak üzere. Özellikle, burada sunulan set-up fiber birleştiğinde giriş lazerler çok renkli uyarma için içerir ve epi- ve tır modları arasında geçiş yapmak için uyarma açı kontrolünü sağlar uyarma yolunda bir ticari aydınlatma kol programlanmış. Emisyon yolundaki bir çıkarılabilir homebuilt silindirik objektif Kaset 3-b SR görüntüleme için mikroskop gövdesi içinde yerleştirilir ve bir ticari ışın ayırıcı seçerek birden fazla emisyon kanal algılamak için etkin bir EMCCD kamera önce yerleştirilir aynı anda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu melez mikroskop sistem birden fazla mikroskoplar satın almak için ortadan kaldırır. Optik tablo, tablo yükleme işçilik, yazılım ve iş istasyonu, dahil bütün parçalar için maliyet yaklaşık $230.000 toplamdır. Mag lens ve 3-b lens, dahil, özel işlenmiş parçalar yaklaşık 700 $ (farklı kurumları gerçek masrafları maliyeti bağlıdır) maliyet. Tipik piyasada bulunan entegre sistemleri tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu fazla 300.000 $ maliyet için ~ 400.000 ve değil kolayca smFRET ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.F. Searle akademisyenler Program ve NIH yönetmenin yeni yenilikçi Ödülü destek kabul eder. Yazar Paul Selvin’ın Lab (Illinois Üniversitesi, Urbana-Champaign) 3-b objektif konumlandırma için yararlı öneriler kabul etmiş oluyorsunuz.
Materials
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 – 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A – f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. . Optical physics. , (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
