Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu
Summary
Bu protokol, intravital mikroskopi ile görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bir farenin omuriliğine cam pencere nin yerleştirilmesini açıklar.
Abstract
Bu protokol, fare omuriliğinin in vivo görüntülemesi için spinal kord laminektomi ve cam pencere implantasyonu için bir yöntem tanımlanmaktadır. Entegre bir dijital buharlaştırıcı isoflurane düşük akış hızında anestezi istikrarlı bir düzlem elde etmek için kullanılır. Tek bir vertebral omurga kaldırılır, ve ticari olarak kullanılabilir bir kapak-cam ince bir agarose yatak üzerine kaplanmış. 3D baskılı plastik bir arka plaka daha sonra doku yapıştırıcı ve diş çimentosu kullanılarak komşu vertebral dikenlere yapıştırılır. Bir sabitleme platformu solunum ve kalp atışı hareket artifakı azaltmak için kullanılır. Bu hızlı ve kelepçesiz yöntem akut multi-foton floresan mikroskopi için uygundur. Bu tekniğin transgenik farelerde spinal kord vaskülatürünün iki foton mikroskobuna uygulanması için temsili veriler eklenmiştir: Claudin-5 — sıkı bir kavşak proteini.
Introduction
Floresan proteinleri ifade eden transgenik hayvan modelleri, intravital mikroskopi ile birleştirildiğinde, biyoloji ve patofizyolojiye yönelik güçlü bir platform sağlar. Omurilik bu teknikleri uygulamak için, görüntüleme için omurilik hazırlamak için özel protokoller gereklidir. Böyle bir strateji bir laminektomi ve omurilik penceresi implantasyonu yapmaktır. Mikroskopi için ideal bir laminektomi protokolünün temel özellikleri arasında doğal doku yapısı nın ve fonksiyonunun korunması, görüntüleme alanının stabilitesi, hızlı işlem süresi ve sonuçların tekrarlanabilirliği sayılabilir. Belirli bir sorun solunum ve kalp atışı tarafından indüklenen harekete karşı görüntüleme alanı stabilize etmektir. Birden fazla ex vivo ve in vivo stratejileri bu hedeflere ulaşmak için bildirilmiştir1,2,3,4,5. En in vivo yöntemleri spinal kolonun kenarlarına kenetleme içerir2,4 ve genellikle sert bir metalcihazimplante takip 3,4 ameliyat sırasında istikrar için ve downstream görüntüleme uygulamaları. Omurilik kıskaç potansiyel kan akışını tehlikeye ve kan-beyin bariyerini neden olabilir (BBB) protein remodeling.
Bu yöntemin amacı, protokolün invazivliğini en aza indirirken ve sonuçları iyileştirirken, omurganın canlı farede optik görüntüleme için kullanılabilir hale getirilmesidir. Biz hala sağlam mekanik kararlılık elde minimal invaziv oval plastik 3D baskılı arka plaka ile eşleştirilmiş tek bir laminektomi ve kapak cam implantasyon prosedürü açıklar. Arka plaka doğrudan diş çimentosu ile anterior ve posterior vertebral dikenler yapıştırılır. Arka plaka sert bir metal kol ile mikroskop aşamasına eklemek vida delikleri ile yanal uzatma kolları ile donatılmıştır. Bu etkili mikroskop aşamasına bozulmamış anterior ve posterior vertebra demirler, aksi takdirde solunum ve kalp atışı ile tanıtılacak hareket artifakı mekanik direnç sağlayan. Yöntem, torasik düzey 12’de tek bir vertebranın laminektomi için optimize edilmiş ve in vivo görüntüleme sırasında stabilite için alternatif stratejilerde kullanılan kıskaçlar atlanmıştır. İşlem hızlıdır ve fare başına yaklaşık 30 dakika süredilir.
Bu protokol BBB’nin hastalık mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir. BBB, merkezi sinir sistemi (CNS) için son derece seçici bir ortam sağlayan endotel hücreleri, vasküler düz kas, perisitler ve astrosit ayak süreçlerinden oluşan dinamik bir mikrovasküler sistemdir. Temsili veriler, gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP): BBB sıkı kavşak proteini Claudin-5’i ifade etmek üzere tasarlanmış transgenik farelerde bu protokolün uygulanmasını betimlemelidir. Sağlanan arka plaka yazdırma dosyaları da alternatif uygulamalar için özelleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntem, cam pencereden farelerdeki omuriliğin kararlı bir şekilde görüntülenmesine olanak sağlar. Bu yöntem transgenik eGFP BBB remodeling değerlendirmek için uygulanmıştır:Claudin5 +/- bir floresan BBB sıkı kavşak proteinifade fareler, ancak omurilik herhangi bir floresan protein veya hücrelerin çalışmaları için eşit derecede iyi uygulanabilir.
Laminektomi ve omurilik stabilizasyonu için birden fazla yöntem geliştirilmiştir. Tüm protokoller, ilg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E. Lutz, Grant KL2TR002002 ve University of Illinois Chicago College of Medicine başlangıç fonları altında Ulusal Çeviri Bilimleri, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Geliştirme Merkezi tarafından desteklenir. Simon Alford RO1 MH084874 tarafından desteklenir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve NIH’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Yazarlar Tg eGFP için Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Nöroloji Bölümü’nde Dritan Agalliu teşekkür:Claudin-5 fareler, bilimsel tartışmalar, ve cerrahi protokol ve görüntüleme uygulamalarının geliştirilmesi içine anlayışlar. Yazarlar California Üniversitesi Nörobiyoloji ve Davranış Bölümü Sunil P. Gandhi teşekkür, Irvine stereotaktik cihaz ve hayvan sıcaklık kontrolörü ilk prototip tasarımı için, cerrahi protokol tartışma, ve iki foton lu mikroskopi eğitimi. Yazarlar ayrıca Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc) cerrahi stereomikroskop özelleştirme de yardım için teşekkür ve Ron Lipinski (Balina İmalat) stereotaktik parçaları işleme için.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
