Fabrikation af anisotrope polymere kunstige Antigen præsentere celler for CD8 + T-celle aktivering
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at hurtigt og reproducerbar generere biologisk inspirerede, biologisk nedbrydelige articifical antigen præsentere celler (aAPC) med afstemmelige størrelse, form og overflade protein præsentation for T-celle ekspansion ex vivo eller in vivo .
Abstract
Kunstige antigen præsentere celler (aAPC) er en lovende platform for immun graduering på grund af deres potent evne til at stimulere T-celler. Acellulær substrater tilbyder vigtige fordele over celle-baserede aAPC, herunder præcis kontrol af signal præsentation parametre og fysiske egenskaber af aAPC overflade til at modulere dens interaktioner med T-celler. aAPC fremstillet af anisotrope partikler, især elliptisk partikler, har vist sig at være mere effektiv end deres sfæriske modstykker til stimulere T-celler på grund af øget bindende og større areal tilgængelig for T-celle kontakter, samt som reduceret uspecifik optagelse og forbedret farmakokinetiske egenskaber. Trods øget interesse for anisotrope partikler, accepteret selv bredt metoder til at generere anisotrope partikler, såsom tynde film stretching kan være en udfordring at implementere og bruge reproducerbar.
Til dette formål, vi beskriver en protokol for den hurtige, standardiseret fabrikation af bionedbrydeligt anisotrope partikel-baseret aAPC med afstemmelige størrelse, form, og signal præsentation for T-celle ekspansion ex vivo eller i vivo, sammen med metoder til at karakteriserer deres størrelse, morfologi og overflade proteinindhold, og vurdere deres funktionalitet. Denne tilgang til at opdigte anisotrope aAPC er skalerbar og reproducerbar, gør det ideelt til at generere aAPC for “hyldevare” immunoterapi.
Introduction
Kunstige antigen præsentere celler (aAPC) har vist lovende som immunmodulerende stoffer, fordi de kan skabe en robust antigen-specifikke T-celle respons. Essential til disse platforme er deres evne til effektivt præsentere vigtige signaler for T-celle aktivering. Acellulær aAPC er et attraktivt alternativ til celle-baserede aAPC, fordi de er nemmere og billigere at fabrikere, færre udfordringer under skala-up og oversættelse, og mindske risici forbundet med celle-baserede behandlinger. Acellulær aAPC også mulighed for en høj grad af kontrol over signal præsentation parametre og fysiske egenskaber af den overflade, der vil kommunikere med T celler1.
aAPC skal sammenfatte mindst to signaler afgørende for T-celle aktivering. Signal 1 giver antigen anerkendelse og opstår, når T-celle receptoren (TCR) genkender og engagerer med en MHC klasse I eller II forsynet med dens beslægtet antigen, som kulminerede i signalering gennem TCR kompleks. For at omgå antigen specificitet behov, bærer aAPC systemer ofte en agonistisk monoklonale antistoffer mod CD3 receptor, som nonspecifically stimulerer TCR kompleks. Rekombinant former for MHC, især MHC multimerer, har også været brugt på overfladen af aAPC for at give antigen specificitet2,3. Signal 2 er en costimulatory signal, der dirigerer T-celleaktivitet. For at give den nødvendige for T-celle aktivering costimulation, er CD28 receptor generelt stimuleret med en agonistisk antistof præsenteret på aAPC overflade, selv om andre costimulatory receptorer som 4-1BB har været succesfuldt målrettet4. Signal 1 og 2 proteiner er typisk immobiliseret på overfladen af stive partikler til at syntetisere aAPC. Historisk set har aAPC været fremstillet af en række materialer, herunder polystyren4,5 og jern dextran6. Nyere systemer udnytter biologisk nedbrydelige polymerer som poly (mælkesyre-co-glycolic acid) (PLGA) til at generere aAPC, der kan kobles nemt til at signalere proteiner og er egnet til direkte administration i vivoog kan lette den vedvarende frigivelse af indkapslet cytokiner eller opløselige faktorer til at forøge T-celle aktivering7,8.
Udover tilstedeværelse af nødvendige signal proteiner er receptor engagement over et tilstrækkeligt stort areal under aAPC/T celle interaktion afgørende for T-celle aktivering. Således fysiske parametre af aAPC størrelse og form drastisk ændre deres tilgængelige kontaktområde og påvirke deres evne til at stimulere T-celler. Micron mellemstore aAPC har vist sig at være mere effektive på stimulere T-celler end deres nanoskala modparter9,10. Nano-aAPC kan dog have superior biodistribution og bedre dræning til lymfeknuderne, der kan forbedre deres præstationer i vivo over mikro-aAPC11. Figuren er en anden variabel af interesse i partikel-baserede aAPC systemer. Anisotropisk aAPC har for nylig vist sig at være mere effektiv end isotropic partikler på stimulere T-celler, hovedsagelig på grund af forbedrede interaktion med target-cellerne kombineret med reduceret uspecifikke celle optagelse. Celler binder sig fortrinsvis til den lange akse af elliptisk partikler, og større radius af krumningen og fladere overflade giver mulighed for mere kontakt mellem aAPC og T-celle12. Den lange akse af elliptisk partikler også afskrækker fagocytose, hvilket resulterer i øget omsætning tid sammenlignet med sfæriske partikler efter i vivo administration12,13. På grund af disse fordele mægle elliptisk partikler større ekspansion af antigen-specifikke T celler in vitro- og i vivo sammenlignet med sfæriske partikler, en effekt observeret på både mikro- og nanoscales12, 13. Der er forskellige strategier til at fabrikere anisotrope partikler, men tynd-hinde stretching er en enkel, almindeligt anerkendte metode bruges til at generere en række forskellige partikel figurer14. Efter syntese, partikler er støbt ind i film og strakte sig i en eller to dimensioner ved en temperatur over glasset overgang temperatur af partikel materiale. Filmen er så opløst for at hente partikler. Trods en voksende interesse for anisotrope partikler, nuværende strategier for opdigte partikel-baserede aAPC er for det meste begrænset til isotropic systemer og metoder til at ændre partikel form kan være vanskelige at gennemføre, uforenelig med visse aAPC syntese strategier, og mangel på præcision og reproducerbarhed15. Vores tynd-hinde strækker teknik kan udføres manuelt eller i en automatiseret måde til hurtigt at generere anisotrope partikler syntetiseret fra en bred vifte af biologisk nedbrydelige polymerer, strakt til en ønskede størrelsesforhold i et eller to dimensioner15.
Baseret på vores tidligere arbejde, udviklede vi en biologisk nedbrydeligt partikel-baserede tilgang kombineret med skalerbar tynd-hinde strækker teknologi til hurtigt at generere aAPC med afstemmelige størrelse og form på en standardiseret måde for T-celle ekspansion ex vivo eller i vivo. Vores protein konjugation strategi kan bruges til at koble eventuelle de(n) af interesse til carboxyl grupper på partikel overflade på en ønskede tæthed, giver denne aAPC system en høj grad af fleksibilitet. Vi beskriver også metoder til at karakterisere størrelse, morfologi og overflade protein indhold af aAPC og evaluere deres funktionalitet i vitro. Denne protokol kan tilpasses nemt at udvide immunceller ex vivo eller i vivo til en lang række immunterapeutisk applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver i detaljer en alsidig metode for den præcise generation af anisotrope polymere partikler. Den tynde film stretching teknik beskrevet her er skalerbar, stærkt reproducerbare og billig. Alternative teknikker til at generere anisotrope partikler lider af mange begrænsninger, herunder høje omkostninger, lav overførselshastighed og begrænset partikelstørrelse. Den tynde film stretching tilgang er også en fordel fordi partiklerne er ændret til at være anisotrope efter syntese og som følge he…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EBA (DGE-1746891) og KRR (DGE-1232825) takke NSF Graduate Research Fellowship program for støtte. RAM tak National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) og præstation belønninger for College forskere Fellowship for støtte. Forfatterne takke NIH (R01EB016721 og R01CA195503), forskning at forebygge blindhed James og Carole gratis katalysator Award, og JHU Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer immunterapi for støtte.
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O’Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
