Herstellung von anisotropen Polymeren künstliche antigenpräsentierende Zellen für CD8 + T-Zell-Aktivierung
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll, um schnell und reproduzierbar generieren biologisch inspirierten, biologisch abbaubaren künstlichen antigenpräsentierende Zellen (aAPC) mit einstellbaren Größe, Form und Oberfläche Protein Präsentation für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder in-vivo .
Abstract
Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPC) sind eine vielversprechende Plattform für Immunmodulation durch ihre starke Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Azelluläre Substrate bieten wichtige Vorteile gegenüber zellbasierte aAPC, einschließlich präzise Steuerung der Präsentation Signalparameter und physikalische Eigenschaften der Oberfläche aAPC zu modulieren, die Interaktion mit T-Zellen. aAPC konstruiert aus anisotropen Partikel besonders Ellipsoid Partikel haben gezeigt, dass effektiver als kugelförmige Gegenstücke an anregenden T-Zellen durch erhöhte Bindung und größere Fläche zur T-Zell, sowie kontaktieren als unspezifische Aufnahme und verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften reduziert. Trotz gestiegenen Interesse an anisotropen Partikel akzeptiert auch weithin Methoden zur Generierung der anisotropen Partikel wie Dünnschicht-Dehnung schwierig sein kann, zu implementieren und verwenden Sie reproduzierbar.
Zu diesem Zweck wir beschreiben ein Protokoll für die schnelle, standardisierte Herstellung von biologisch abbaubaren anisotropen partikelbasierte aAPC mit einstellbaren Größe, Form und Präsentation für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder in Vivozusammen mit Methoden, um zu signalisieren Ihre Größe, Morphologie und Oberfläche Eiweißgehalt zu charakterisieren und ihre Funktionalität zu bewerten. Dieser Ansatz zur Herstellung von anisotropen aAPC ist skalierbar und reproduzierbar, ideal für die Erzeugung von aAPC für “handelsübliche” Immuntherapien.
Introduction
Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPC) haben als immunmodulatorische Mittel Versprechen gezeigt, weil sie eine robuste antigenspezifischen T-Zell-Antwort generieren können. Wesentlich für diese Plattformen sind ihre Fähigkeit, entscheidende Signale für die T-Zellaktivierung effizient zu präsentieren. Azelluläre aAPC sind eine attraktive Alternative zur Zell-basierte aAPC, weil sie sind einfacher und kostengünstiger herzustellen, weniger Herausforderungen während der Scale-Up und Übersetzung und Risiken im Zusammenhang mit zellbasierten Therapien zu lindern. Azelluläre aAPC ermöglichen auch ein hohes Maß an Kontrolle über die Präsentation Signalparameter und physikalische Eigenschaften der Oberfläche, die mit T-Zellen-1-Schnittstelle wird.
aAPC muss ein Minimum von zwei Signalen für T-Zellaktivierung rekapitulieren. Signal 1 sorgt für Antigen-Erkennung und tritt auf, wenn die T-Zell-Rezeptor (TCR) erkennt und setzt sich mit einem MHC-Klasse I oder II trägt seine cognate Antigen ihren Höhepunkt bei der Signalisierung durch die TCR Komplex. Um die Antigen-Spezifität-Anforderung umgehen, tragen aAPC Systeme oft einen agonistischen monoklonale Antikörper gegen CD3-Rezeptor, der nonspecifically den TCR-Komplex stimuliert. Rekombinante Formen der MHC, besonders MHC Multimere wurden auch auf der Oberfläche des aAPC zur Antigen-Spezifität2,3liefern. Signal 2 ist ein costimulatory Signal, das T-Zell-Aktivität leitet. Um die Costimulation für die T-Zell-Aktivierung notwendig zu gewährleisten, wird der CD28-Rezeptor in der Regel mit einem agonistische Antikörper auf der Oberfläche aAPC präsentiert angeregt, obwohl andere costimulatory Rezeptoren wie 4-1BB erfolgreich gezielte4gewesen. Signalproteinen 1 und 2 sind in der Regel auf der Oberfläche der festen Partikel aAPC synthetisieren immobilisiert. In der Vergangenheit wurden aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich Polystyrol4,5 und Eisen Dextran6aAPC hergestellt. Bei neueren Systemen nutzen, biologisch abbaubaren Polymeren wie Poly (Milchsäure-co-glykolische Säure) (PLGA) aAPC zu generieren, die können einfach gekoppelt werden, um Proteine zu signalisieren, eignen sich für direkte Verwaltung in Vivound verzögerter Freisetzung von erleichtern kann gekapselt, Zytokine oder lösliche Faktoren, die T-Zell-Aktivierung7,8ergänzen.
Neben der Präsenz von signalproteinen notwendig unbedingt Rezeptor Engagement über eine ausreichend große Fläche während der aAPC/T Zelle Interaktion T-Zell-Aktivierung. So physikalischen Parameter der aAPC wie Größe und Form drastisch verändern ihre verfügbaren Kontaktfläche und Einfluss auf ihre Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Mikron mittelständische aAPC haben nachweislich effektiver auf anregende T-Zellen als ihre nanoskaligen Pendants9,10. Nano-aAPC haben jedoch überlegene Bioverteilung und bessere Entwässerung in die Lymphknoten, die ihre Leistung in Vivo über Mikro-aAPC11verbessern kann. Form ist eine weitere Variable des Interesses an partikelbasierte aAPC Systeme. Anisotrope aAPC vor kurzem nachweislich wirksamer als isotrop Partikel an anregenden T-Zellen, vor allem durch verbesserte Interaktion mit Zielzellen gepaart mit reduzierten unspezifische Zelle Aufnahme. Zellen bevorzugt an der Längsachse der Ellipsoid Partikel binden, und der größere Radius der Krümmung und flacher Oberfläche ermöglichen mehr Kontakt zwischen den aAPC und T-Zell-12. Die Längsachse der Ellipsoid Partikel schreckt auch Phagozytose, wodurch erhöhte Zirkulation Zeit im Vergleich zu sphärischen Partikel folgen in Vivo Verwaltung12,13. Aufgrund dieser Vorteile vermitteln Ellipsoid Teilchen größere Expansion der antigenspezifischen T Zellen in Vitro und in Vivo im Vergleich zu sphärischen Partikel, ein Effekt zu beobachten, bei der Mikro- und Nanoscales12, 13. Es gibt verschiedene Strategien, anisotrope Partikel zu fabrizieren, aber Dünnschicht-stretching ist eine einfache, allgemein anerkannten Methode verwendet, um eine Reihe von unterschiedlichen Teilchen Formen14zu generieren. Nach Synthese Partikel sind warfen in Filme und in einer oder zwei Dimensionen auf einer Temperatur oberhalb der Glasübergangstemperatur der partikelmaterial gestreckt. Der Film wird dann aufgelöst, um die Partikel abzurufen. Trotz wachsendem Interesse an anisotropen Partikel, aktuelle Ansätze zur Herstellung partikelbasierte aAPC beschränken sich meist auf isotrope Systeme und Methoden ändern, Kornform kann schwierig zu implementieren, nicht kompatibel mit bestimmten aAPC-Synthese Strategien und Mangel an Präzision und Reproduzierbarkeit15. Unsere Dünnschicht-Technik kann manuell durchgeführt werden oder in einer automatisierten Weise schnell anisotropen Partikel, die aus einer Vielzahl von biologisch abbaubaren Polymeren synthetisiert erzeugt, gestreckt, um eine gewünschte Seitenverhältnis in ein oder zwei Dimensionen15.
Basierend auf unserer bisherigen Arbeit, entwickelten wir einen biologisch abbaubaren Teilchen basierender Ansatz kombiniert mit skalierbaren Dünnschicht-stretching Technik rasch aAPC mit einstellbaren Größe und Form in einer standardisierten Weise für T-Zell Erweiterung ex Vivo oder erzeugen in Vivo. Unsere Protein Konjugation Strategie lässt sich jede benutzt von Interesse an Carboxylgruppen an der Partikeloberfläche in einer gewünschten Dichte geben diesem aAPC-System ein hohes Maß an Flexibilität zu koppeln. Wir beschreiben auch Methoden zur Größe, Morphologie und Oberfläche Eiweißgehalt von aAPC zu charakterisieren und ihre Funktionalität in Vitrozu bewerten. Dieses Protokoll kann immunen Zellen ex Vivo oder in Vivo für eine Vielzahl von immuntherapeutischen Anwendungen erweitern leicht angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine vielseitige Methode für die genaue teilchenerzeugung anisotropen Polymeren. Die dünne Folie dehnen hier beschriebene Technik ist skalierbar, reproduzierbare und preiswert. Alternative Techniken zur Erzeugung von anisotropen Partikel leiden viele Einschränkungen, einschließlich hohe Kosten, niedrige Durchsatz und begrenzte Partikelgröße. Die dünne Folie dehnen Ansatz ist auch vorteilhaft, weil die Partikel geändert werden, um nach der Synthese anisotrop sein, und infolgedessen ist …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die NSF Graduate Research Fellowship-Programm für die Unterstützung danken EBA (DGE-1746891) und KRR (DGE-1232825). RAM Dank der nationalen Forschung Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) und die Belohnungen für deine Leistungen für College-Wissenschaftler-Stipendium für Unterstützung. Die Autoren danken den NIH (R01EB016721 und R01CA195503), die Forschung zu verhindern, dass Blindheit James und Carole kostenlose Catalyst Award, und der JHU Bloomberg-Kimmel Institut für Krebs-Immuntherapie für Unterstützung.
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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