Fabricación de Anisotropic antígeno Artificial polimérico que presenta las células para la activación de células T CD8 +
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de forma rápida y reproducible generar biológicamente inspirado, biodegradable articifical antígeno que presenta las células (aAPC) con tamaño ajustable, forma y presentación de proteína de la superficie de la célula de T expansión ex vivo o en vivo .
Abstract
Antígeno artificial que presenta las células (aAPC) son una prometedora plataforma para modulación inmune debido a su potente capacidad para estimular las células T. Acelulares sustratos ofrecen ventajas sobre aAPC basadas en células, incluyendo un control preciso de los parámetros de presentación de señal y las características físicas de la superficie de la aAPC para modular las interacciones con las células de T. aAPC construido a partir de partículas anisotrópicas, partículas especialmente elipsoidales, han demostrado ser más eficaz que sus contrapartes esféricas a estimulantes células T debido a la mayor unión y mayor superficie disponible para la célula de T de contacto, así disminución de la absorción no específica y propiedades farmacocinéticas mejoradas. A pesar del creciente interés partículas anisotrópicas, incluso ampliamente aceptados métodos de generar partículas anisotrópicas como estiramiento de película delgada puede ser un desafío implementar y usar de manera reproducible.
Para ello, describimos un protocolo para la fabricación rápida y estandarizada de biodegradable anisotrópico aAPC basada en partículas con tamaño ajustable, forma y señal de presentación de la célula de T expansión ex vivo o en vivo, junto con métodos para caracterizan su tamaño, morfología y superficie contenido en proteínas y para evaluar su funcionalidad. Esta forma de fabricación de aAPC anisotrópico es escalable y reproducible, lo que es ideal para la generación de aAPC para inmunoterapias “estándares”.
Introduction
Las células que presenta antígenos artificiales (aAPC) han demostrado promesa como agentes inmunomoduladores porque pueden generar una respuesta robusta célula de T antígeno-específica. Esencial para estas plataformas son su capacidad para presentar eficientemente señales cruciales para la activación de células T. AAPC acelular son una alternativa atractiva a aAPC celulares porque son más fáciles y menos costosos de fabricar, menos dificultades durante el escalado y traducción y mitigar los riesgos asociados con las terapias basadas en células. AAPC acelular también permiten un alto grado de control sobre los parámetros de presentación de señal y características físicas de la superficie que se une con las células de T1.
aAPC debe recapitular un mínimo de dos señales esenciales para la activación de células T. Señal 1 proporciona el reconocimiento del antígeno y se produce cuando el receptor T (TCR) reconoce y compromete con un MHC de clase I o II con su antígeno cognado, culminando en la señalización a través del complejo TCR. Para omitir el requisito de especificidad de antígeno, aAPC sistemas a menudo llevan un agonístico anticuerpo monoclonal contra el receptor CD3, que estimula un complejo TCR. Formas recombinantes de MHC, particularmente MHC Multímeros, han utilizado también en la superficie de aAPC para proporcionar especificidad de antígeno2,3. Señal 2 es una señal costimulatory que dirige la actividad de las células T. Para proporcionar la coestimulación necesaria para la activación de células T, el receptor CD28 generalmente es estimulado con un anticuerpo agonístico presentado en la superficie de la aAPC, aunque otros receptores costimulatory como 4-1BB han dirigido con éxito4. Proteínas de señal 1 y 2 normalmente son inmovilizadas en la superficie de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Históricamente, aAPC han sido fabricados de una variedad de materiales, incluyendo poliestireno4,5 y hierro dextrano6. Los sistemas más nuevos utilizan polímeros biodegradables como poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) para generar aAPC que puede acoplarse fácilmente para señalar las proteínas, es convenientes para la administración directa en vivoy puede facilitar la liberación de encapsulado de citocinas o factores solubles al aumentar la activación de la célula de T7,8.
Además de la presencia de proteínas de señal necesario, compromiso del receptor sobre una superficie suficientemente grande durante la interacción de la célula de la aAPC/T es esencial para la activación de células T. Así, parámetros físicos de la aAPC tales como tamaño y forma drásticamente alteran su área disponible de contacto y afectan su capacidad para estimular las células T. AAPC tamaño micrométrico han demostrado ser más eficaz en estimular las células de T que sus contrapartes de nanoescala9,10. Sin embargo, puede tener nano-aAPC biodistribución superior y mejor drenaje a los ganglios linfáticos que pueden mejorar su rendimiento en vivo sobre micro-aAPC11. La forma es otra variable de interés en sistemas basados en partículas aAPC. AAPC anisotrópico se han demostrado recientemente para ser más eficaz que partículas isotrópicas a estimular las células T, debido principalmente a la mayor interacción con las células diana junto con captación reducida celular inespecífica. Células se unen preferentemente al eje longitudinal de las partículas elipsoidales, y el mayor radio de curvatura y la superficie plana permite más contacto entre la aAPC y de la célula de T12. El eje largo de las partículas elipsoidales también desalienta la fagocitosis, dando por resultado la circulación creciente de tiempo que las partículas esféricas siguiendo en vivo administración12,13. Debido a estas ventajas, las partículas elipsoidales median una mayor expansión de específica de antígeno las células T en vitro y en vivo en comparación con las partículas esféricas, un efecto observado en el micro y nanoscales12, 13. Hay varias estrategias para fabricar partículas anisotrópicas, pero película delgada que se extiende es un método simple, ampliamente aceptado para generar una amplia gama de partículas diversas formas14. Tras la síntesis, las partículas son en películas y se extendía en una o dos dimensiones a una temperatura por encima de la temperatura de transición vítrea del material de partículas. La película entonces se disuelve para recuperar las partículas. A pesar de un creciente interés en las partículas anisotrópicas, enfoques actuales de fabricación aAPC basada en partículas en su mayoría se limitan a isotrópicos sistemas y métodos de alterar la forma de la partícula pueden ser difícil de implementar, incompatibles con determinadas síntesis de aAPC estrategias y falta de precisión y reproducibilidad15. Nuestra técnica de estiramiento de película delgada puede ser realizado manualmente o en forma automática para generar rápidamente las partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de una variedad de polímeros biodegradables, se extendía a una relación de aspecto deseada en una o dos dimensiones15.
Basado en nuestro trabajo anterior, hemos desarrollado un enfoque basados en partículas biodegradable combinado con escalable tecnología de película delgada que estira para rápidamente generar aAPC con forma y tamaño ajustable de manera estandarizada para la expansión de la célula de T ex vivo o en vivo. Nuestra estrategia verbal de proteína se puede utilizar para acoplar cualquier proteína de interés a los grupos carboxilo en la superficie de la partícula en una densidad deseada, dando un alto grado de flexibilidad a este sistema aAPC. También se describen métodos para caracterizar el tamaño, la morfología y la proteína de la superficie de aAPC y para evaluar su funcionalidad en vitro. Este protocolo puede ser muy fácilmente adaptable para expandir las células inmunes ex vivo o en vivo para una variedad de aplicaciones de inmunoterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo detalla un método versátil para la generación precisa de anisotrópicas partículas poliméricas. La película fina estiramiento técnica descrita aquí es escalable, altamente reproducible y económica. Técnicas alternativas para la generación de partículas anisotrópicas sufren muchas limitaciones, incluyendo alto costo, bajo rendimiento y tamaño de partícula limitada. La película fina estiramiento enfoque también es ventajosa porque las partículas se modifican para ser anisotrópicas después…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EBA (DGE-1746891) y KRR (DGE-1232825) gracias al programa de beca de investigación postgrado NSF para apoyo. Memoria RAM gracias a la investigación nacional servicio Premio NIH NCI F31 (F31CA214147) y las recompensas del logro para colegio científicos becas de apoyo. Los autores agradecen los NIH (R01EB016721 y R01CA195503), la investigación para prevenir ceguera James y Carole gratis Premio de catalizador y el Instituto de Bloomberg-Kimmel JHU de inmunoterapia del cáncer para la ayuda.
Materials
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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