哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

Summary

ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。

Abstract

彼らの生理学的環境で哺乳類細胞はしばしば細胞膜損傷力学的および生化学的ストレスにさらされます。これらの損害に対し、複雑な分子機械は急速にそのバリア機能を回復し、細胞の生存を維持する細胞膜を再シールします。にもかかわらず、この分野の研究の 60 年間、我々 はまだ機械を再シールする細胞の完全に理解を欠いています。細胞成分の同定の目的とその制御膜を再シールまたは、再シールを改善できる薬開発した哺乳類細胞における効率を再封止膜を測定する蛍光ベースの高スループット試金マイクロ プレートで培養しました。細菌の孔形成毒素リステリオリジン O (LLO) は、大規模な 30-50 nm 径のタンパク質はコレステロールを含むの細孔を形成するのにさらされている細胞膜損傷のためのモデル システムとして膜。温度制御マルチモード マイクロ プレート リーダーは、明視野観察と細胞の蛍光顕微鏡との組み合わせで迅速・高感度カルバゾール測定に使用します。膜非透過性核酸結合の螢光によって放射される蛍光強度の速度論的解析および効率を再シールするセルの計算を可能にするセルの人口レベルで再封止膜の範囲を反映します。.蛍光顕微鏡イメージング恒常蛍光核蛋白質ヒストン 2 の b の数の潜在的な変化を考慮するマイクロ プレートの各ウェルに、キメラを表現でき、最終的な細胞の列挙が可能します。異なる細胞集団の同定。この高スループット試金は、宿主遺伝子のスクリーニングを介して膜修復メカニズムの私達の理解を拡大するまたは追加外因の強力なツールは、その制御膜を再シール化合物です。

Introduction

哺乳類細胞膜の完全性の損失で、その結果機械、浸透、および生化学的ストレス予告があります。迅速かつ効率的な再封止、なし損傷した細胞プログラムまたは壊死死にすぐに屈する。プロセスを再封止膜を理解する努力は、1960 年代以降、その機能障害に関連付けられている壊滅的な結果によってが動機になっています。確かに、ベイジュ症候群、糖尿病、肢帯型筋ジストロフィーなどの病気は、突然変異遺伝子符号化ジスフェリン、高度の glycation の最終製品の生産や欠陥による欠損細胞膜修復にリンクされています。ライソゾーム人身売買レギュレータ CHS1、それぞれ^1,2,3,4,5,6。しかし、まで、膜の私達の理解を再シールはまだ限られた⁷です。初期の研究は、細胞外 Ca^{2 +}膜破損した^8,9,10までの流入によって膜を再シールを開始することを示しています。その後、いくつか非相互に排他的な Ca^{2 +}の細胞を再シールするのに依存のメカニズムが提案されています。パッチの仮説は、傷口に近接、細胞内小胞がお互いとパッチ^11,12,13,14として破損した細胞膜融合を提案します。2 番目のモデルは、カルシウム依存性の開口放出を提案する傷をリソソームのサイト リリース ライソゾーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンをセラミド細胞膜の外側のリーフレットに変換します。脂質組成の変化は、損傷領域^15,16,17のセラミド駆動エンドサイトーシスの結果します。最後に、3 つめの提案されたメカニズムには、エンドソーム並べ替えを複雑なトランスポート (ESCRT) 膜¹⁸から発芽する外向きの小胞の形成を促進するために必要な役割が含まれます。蛋白質の限定セットのみがこれらのモデルで識別され、その機械をさらに解明する必要があります。

ここ付着性哺乳類細胞における効率を再封止膜が損傷を受けた措置を介する遺伝子組換えリステリオリジン O (LLO)¹⁹高スループット試金を記述します。LLO リステリア菌^20,21,22通性細胞内病原体によって分泌される孔形成毒素 (PFT) を MACPF/CDC に属する (膜の攻撃の複合体、パーフォリンとコレステロール依存性 cytolysin) スーパーファミリー。MACPF は、哺乳類の気孔形成グラム陽性の病原体の病原性ライフ スタイル²³を促進するために宿主細胞に損傷を与えるプロデュース CDCs 主に細菌毒素に対し免疫防御に関与するタンパク質。CDCs は水溶性モノマーとして合成される化や細胞膜に存在コレステロールに結合する二量体まで 50 サブユニットの孔形成前の複合体に oligomerize複雑な prepore は、直径^24,25,,262730-50 nm にわたる β バレル型細孔を形成脂質全体の β ストランドを挿入するのには、再配置します。 これらの大きな毛穴がセルのうちイオンと小型携帯電話部品のフラックスを許可します。しかし、いくつかの研究は、小さいサイズの細孔が形成された^28,29,30も提案しています。CDCs、間 LLO ハイスループット解析^31,32を助長している不可逆的な pH と温度依存性の集計を含む固有のプロパティが表示されます。LLO は 4 ° C、孔複合体の形成ではなく、細胞への結合に許容温度で細胞培養液に追加できます。ポア形成の開始は、細孔生成に関与するフォーム オリゴマーに膜面での毒素分子の効率的な拡散と構造改造を許可する、37 ° C に温度を上げることによって、同期できます。したがって、細胞の損傷の運動、温度スイッチ、次は、細胞膜にバインド毒素の量に依存します。重要なは、水溶性 LLO (細胞膜にはバインドされていない) 迅速かつ不可逆的集約温度 37 ° C、非連結の毒素分子を離れて洗浄する必要性を軽減し、時間をかけて膜損傷の程度を制限に達したとき。最後に、LLO コレステロール バインド コレステロール豊富な膜で毛穴を形作るため、この試金は哺乳類細胞の広い範囲に従う。おいて LLO ホスト細胞の気孔の形成を介して主にシグナル伝達に影響を与えることが重要です間隙に依存しないセルのいくつかの例外を持つシグナルが発生する^{33,34,35,36 ,37,38,39}。したがって、ことはできませんその LLO 活動は細胞膜修復のプロセスに影響を及ぼす信号を除外します。

この試金は直接セル、セル非透過性螢光色素 (例えば、ヨウ化 propidium) 受動的負傷者の細胞に入ると核酸に関連付けられると、高輝度になります定款を測定することにより負傷の程度を評価します。.したがって、螢光色素は細胞を傷つけるのリアルタイム解析をできるように、実験を通して細胞培養培地で維持できます。核酸結合色素の蛍光強度は毒素の濃度が増えるし、毒素の濃度が増加時間をかけてすべての細孔が形成され、細胞は完全に修復されか、飽和に達するまで。細胞外 Ca^{2 +}膜の気孔を通して流入は、再封止かやりイベントです。したがって、resealing の効率が直接判明しない細胞 Ca^{2 +}で負傷する Ca^{2 +} (修理寛容な条件) を含む培地の負傷を比較して-無料媒体 (修理制限条件)。核酸結合色素の蛍光強度は直接各ウェルの細胞濃度に比例しているので、すべての井戸で同じ濃度でシード セルに重要です。また、細胞の剥離が発生しないこと、フローティングとして集計されるセルは、データの解釈を複雑にするかもしれない蛍光測定値を隠すことができるように試験の前後に、各ウェルの細胞を列挙することが重要です。細胞を列挙するには、ローカライズされた核ヒストン 2B GFP (H2B GFP) を発現する細胞は、この試金で使用されました。温度制御、マルチモード マイクロ プレート リーダー迅速、高スループット計測計測を組み合わせる (96 または 384 ウェル プレート フォーマットを使用して) 蛍光強度の 37 ° c. で生きている細胞の顕微鏡イメージングの後者は細胞数を列挙し、異なる細胞集団の最終的な形成を観察に使用できます。

最終的には、この試金はホスト分子のスクリーニングによって膜修復機構の複雑さの彼らの知識を拡大する機能をユーザーに提供または外追加化合物膜を制御する修理します。次のプロトコル LLO 細胞の resealing の効率を測定する実験の手順を説明し、ある薬剤または再シール効率で細胞治療の効果を評価します。

Protocol

1. 準備 電池めっき注: ひと子宮頸の上皮細胞、hela 細胞、hela 細胞のヒストン 2B GFP (H2B GFP) を表現するがこのプロトコルで使用されていたが、この試金は他の哺乳類細胞19に合わせることができます。 0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL で細胞を洗浄することにより付着性のセル 75 cm2細胞培養用フラスコからをデタッチします。新鮮なトリプシン-EDTA 0.25 %2 mL …

Representative Results

細胞数測定精度: HeLa 細胞は膜修復機構を探索、モデル哺乳類セルラインとして頻繁に。セルの人口レベルの細胞膜修復を評価し、適切なデータ解釈のすべての井戸で同じ濃度で細胞をプレートすることが重要です。また、井戸の間で、細胞数が同等である試金の時に確認することが重要です。恒常ヒストン 2B (H2B GFP) GFP の融合を表現する HeLa 細胞は、自動的にその蛍…

Discussion

この試金は高スループット容量を持つセルの人口レベルで再封止膜の効率を測定します。使用できる細胞成分や細胞膜修復に影響を与える薬物ライブラリの画面に。説明アッセイは 96-well 版のフォーマットを使用、高いスループット 384 ウェル プレートに合わせることができます。このアッセイの利点は、過剰な細胞など細胞の剥離、固定、または蛍光標識後固定処理を必要とせずリアルタ?…

Materials

SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 Imaging cytometer	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Propidium Iodide	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Trypsin-EDTA 0.25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate	Corning	3603
Hanks' balanced Salts	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-Glucose, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG