Medida de alto rendimiento de membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos
Summary
Aquí describimos un análisis basado en la fluorescencia de alto rendimiento que mide la membrana plasmática resellado eficiencia mediante análisis fluorométrico y proyección de imagen en células vivas. Este ensayo puede utilizarse para la detección de drogas o genes diana que regulan el cierre de membrana plasmática en células de mamíferos.
Abstract
En su entorno fisiológico, células de mamíferos a menudo son sometidas a tensiones mecánicas y bioquímicas que resultan en daño de la membrana plasmática. En respuesta a estos daños, maquinarias moleculares complejas rápidamente volver a cerrar herméticamente la membrana plasmática para recuperar su función de barrera y mantener la supervivencia celular. A pesar de 60 años de investigación en este campo, todavía no tenemos un conocimiento profundo de la célula resellado maquinaria. Con el objetivo de identificar los componentes celulares cierre de membrana del plasma de control o fármacos que pueden mejorar el servicio, hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento basado en la fluorescencia que mide la membrana plasmática resellado eficacia en células de mamíferos cultivadas en microplacas. Como sistema modelo para el daño de la membrana plasmática, las células se exponen a la bacterianas formadoras de poro toxina listeriolysin O (LLO), que forma grandes 30-50 nm de diámetro proteínico poros en colesterol membranas. El uso de un lector de microplacas de varios modos de funcionamiento con control de temperatura permite mediciones spectrofluorometric rápido y sensible en combinación con brightfield y de imágenes de microscopía de fluorescencia de las células vivas. Análisis cinético de la intensidad de fluorescencia emitida por un fluorocromo membrana de unión a ácidos nucleicos impermeant reflejan el grado de membrana heridos y el cierre a nivel de la población de células, lo que permite el cálculo de la celda resellado eficiencia . Imágenes de microscopía de fluorescencia permite la enumeración de las células, que constitutivamente expresan una quimera fluorescente de la nuclear de la proteína histona 2B, en cada pocillo de la microplaca para tener en cuenta posibles variaciones en su número y permite la eventual identificación de poblaciones celulares distintas. Este ensayo de alto rendimiento es una poderosa herramienta pretende ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de reparación de la membrana mediante proyección de genes host o exógeno agregado compuestos eso membrana del plasma de control resellado.
Introduction
Células de mamífero están sujetos a estrés mecánico, osmótico y bioquímico, resultando en la pérdida de la integridad de la membrana plasmática. Sin cierre rápido y eficiente, las células dañadas sucumbirían rápidamente a la muerte programada o necrótica. Desde la década de 1960, esfuerzos por entender la membrana plasmática resellado proceso han sido motivados por las devastadoras consecuencias asociadas con sus disfunciones. De hecho, enfermedades como miembro-rodea Distrofia Muscular, diabetes, síndrome de Chediak-Higashi se han ligado a membrana del plasma deficiente reparación debido a mutaciones en el gene codificación dysferlin, producción de productos finales de glicación avanzada o defectos en el regulador de tráfico lisosomal gen CHS1, respectivamente1,2,3,4,5,6. Sin embargo, hasta la fecha, nuestra comprensión de la membrana de cierre es todavía limitado7. Estudios iniciales han demostrado que la membrana resellado se inicia por la afluencia de extracelular Ca2 + a través de la membrana plasmática dañada8,9,10. Desde entonces, varios no-excluyentes Ca2 +-dependiente de mecanismos han sido propuestos para sellar las células. La hipótesis de parche propone que cerca de la herida, vesículas intracelulares se fusionan unos con otros y la membrana de plasma dañada para actuar como un parche11,12,13,14. Un segundo modelo propone que exocitosis dependiente de calcio de lisosomas en la herida sitio lanza la esfingomielinasa ácida lysosomal de la enzima, que convierte la esfingomielina a ceramida en el prospecto externo de la membrana plasmática. Este repentino cambio en la composición de lípido produce endocitosis ceramida-conducido de la región dañada15,16,17. Por último, el tercer mecanismo propuesto consiste en un papel para la endosomal clasificación compleja necesaria para que el transporte (TRASVESTIS) para promover la formación de vesículas de exteriores que brote fuera de la membrana plasmática18. Sólo un conjunto limitado de proteínas fue identificado en estos modelos, y su maquinaria debe ser aclarado aún más.
Aquí describimos un análisis de alto rendimiento que medidas de la membrana plasmática resellado eficacia en células de mamífero adherentes sujeto a daño mediadas por recombinante listeriolysin O (LLO)19. LLO es una toxina formadora de poros (PFT) secretada por el patógeno intracelular facultativo Listeria monocytogenes20,21,22 y pertenece a MACPF/CDC (complejo de ataque a membrana, perforin, y Superfamilia cytolysin dependiente de colesterol). MACPF son mamífero poro-formando las proteínas implicadas en las defensas inmunitarias, que son las toxinas bacterianas principalmente producción por patógenos gram-positivos que dañan las células del huésped para promover sus estilos de vida patógenos23. CDC se sintetiza como monómeros solubles en agua o dímeros que se unen al colesterol presentan en la membrana plasmática y oligomerize en un prepore complejo de subunidades hasta 50. El complejo del prepore luego reorganiza para insertar β-filamentos a través de la bicapa lipídica, formando un poro barril β que se extiende por 30-50 nm de diámetro24,25,26,27. Estos poros grandes permiten flujos de iones y componentes celulares pequeños dentro y fuera de la célula; sin embargo, algunos estudios han propuesto que los poros de tamaños más pequeños son también formado28,29,30. Entre la CDC, LLO muestra características únicas incluyendo la agregación irreversible de dependiente de pH y temperatura, que es propicia para el análisis de alto rendimiento31,32. LLO se puede Agregar al medio de cultivo de células a 4 ° c, una temperatura permisiva para su unión a las células, pero no a la formación de lo complejos del poro. Inicio de formación de poro se puede sincronizar luego por aumento de la temperatura a 37 ° c, permitiendo para la eficiente difusión de las moléculas de toxina en el plano de la membrana a oligómeros de forma y para la remodelación conformacionales implicados en la generación de poro. Por lo tanto, después el interruptor de temperatura, la cinética de daño celular depende de la cantidad de toxina a la membrana plasmática. Lo importante, LLO soluble (no limitado a la membrana plasmática) rápidamente e irreversiblemente agregados cuando la temperatura alcance 37 ° c, que alivia la necesidad de eliminar las moléculas de la toxina no unida y limita la extensión del daño de la membrana con el tiempo. Por último, porque LLO se une al colesterol y forma poros en las membranas ricas en colesterol, este ensayo es sensible a una amplia gama de células de mamíferos. Es importante tener en cuenta que LLO afecta a la célula huésped señalización principalmente a través de formación de poro, con algunas excepciones en que celda independiente del poro de señalización puede ocurrir33,34,35,36 ,37,38,39. Por lo tanto, no puede ser excluido que LLO señalización actividades pueden influir en el proceso de reparación de la membrana.
Este análisis evalúan directamente el grado de herir la célula mediante la medición de la incorporación de una célula impermeant fluorocromo (p. ej., yoduro de propidio) que entra en las células heridas pasivo y se convierte en altamente fluorescente cuando se asocia a ácidos nucleicos . Por lo tanto, se puede mantener el fluorocromo en el medio de cultivo celular durante todo el experimento, permitiendo análisis en tiempo real de células herir. La intensidad de la fluorescencia del tinte de unión a ácidos nucleicos aumentará con la concentración de la toxina y, para una determinada concentración de toxina, se incrementará con el tiempo hasta que se forman todos los poros y las células se reparan completamente o hasta que se alcanza la saturación. La afluencia de extracelular Ca2 + a través de los poros de la membrana es un evento de la condición sine qua non para volver a sellar. Por lo tanto, la eficacia de la mismo-resellado puede ser evidenciada indirectamente comparando células heridas en medio de cultivo con Ca2 + (condición permisiva de reparación) para herir en un Ca2 +-medio libre (condición restrictiva de reparación). Debido a la intensidad de la fluorescencia del tinte de unión a ácidos nucleicos es directamente proporcional a la concentración de células en cada pozo, es importante para las células de la semilla en la misma concentración en todos los pocillos. También es importante enumerar las células en cada pozo antes y después del ensayo para asegurar que la separación de la célula no ocurre, como flotando, agregadas células pueden ocultar lecturas de fluorescencia que pueden complicar la interpretación de los datos. Para enumerar las células, las células que expresan las histonas nucleares localizados 2B-GFP (GFP-H2B) fueron utilizadas en este ensayo. Control de temperatura, varios modos de funcionamiento, los lectores de microplacas combinan medidas rápidas, alto rendimiento (utilizando un formato de 96 o 384 pocillos de la placa) de las intensidades de fluorescencia con imagen de microscopía de células vivas a 37 ° C. Este último puede utilizarse para enumerar el número de células y observar la posible formación de poblaciones celulares distintas.
En definitiva, este ensayo proporciona a los usuarios la capacidad de ampliar su conocimiento de la complejidad de los mecanismos de reparación de la membrana mediante la detección de las moléculas del anfitrión o exógeno agregados compuestos que pueden controlar la membrana de reparación. El siguiente protocolo se describen los pasos experimentales para medir la eficiencia mismo-resellado de las células expuestas a LLO y evaluar los efectos de un determinado medicamento o tratamiento celular en eficiencia mismo-resellado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensayo mide la eficiencia de cierre de membrana a nivel de población celular con capacidad de alto rendimiento. Puede ser utilizado para detectar componentes celulares o las bibliotecas de drogas que pueden afectar la reparación de la membrana. El ensayo descrito utiliza un formato de placa de 96 pocillos, pero puede ser adaptado para placas de 384 pocillos para un mayor rendimiento. Una ventaja de este ensayo es su capacidad para obtener medidas de fluorescencia de las células vivas adherente en tiempo real sin …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) para que amablemente nos permite utilizar su plataforma de detección de varios modos de funcionamiento para algunos experimentos preliminares. En este artículo de investigación fue apoyado por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud con el número de concesión RO1AI107250 a Stephanie Seveau. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.
Materials
| SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | i3x | |
| MiniMax 300 Imaging cytometer | Molecular Devices | 5024062 | |
| TO-PRO-3 | ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Propidium Iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
| HeLa | ATCC | CCL2 | |
| HeLa H2B-GFP | Millipore | SCC117 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| 96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate | Corning | 3603 | |
| Hanks' balanced Salts | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| EGTA | ISC BioExpress | 0732-100G | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-(+)-Glucose, HybriMax | Sigma-Aldrich | G5146-1KG |
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