تحديد الكفاءة الإنجابية التي تؤكد بداية البلوغ، والقيام تحليل خصوبة في الفئران والجرذان
Summary
العديد من العلاجات والطفرات الجينية تؤثر على توقيت النضج الجنسي والخصوبة. ويصف هذا البروتوكول طريقة غير الغازية لتقييم بداية البلوغ في الفئران والجرذان قبل إعداد دراسة خصوبة في الحيوانات الناضجة جنسياً.
Abstract
تقييم الكفاءة الإنجابية أمر بالغ الأهمية لفهم تأثير المعاملة أو التلاعب بالجينات على محور الإنجابية، كما وصف المحور طائي جوندال الغدة النخامية. المحور الإنجابية هو integrator رئيسية المدخلات البيئية والداخلية تكييف الخصوبة إلى الظروف المواتية للاستنساخ. قبل الشروع في دراسة خصوبة في الفئران والجرذان، يتم تقييم النضج الجنسي لاستبعاد إمكانية أن تعمل الإنجابية ملاحظتها هي سبب تأخر أو تغيب بداية البلوغ. ويصف هذا البروتوكول نهجاً غير الغازية لتقييم بداية البلوغ في الذكور من خلال تحديد فصل بريبوتيال، وفي الإناث عن طريق فتح المهبل والسفاد الأول. بعد التأكد من إتمام البلوغ وبلوغ مرحلة النضج الجنسي، يمكن الشروع في دراسة خصوبة. يصف الإجراء شروط التربية المثلى للفئران والجرذان وكيفية إعداد دراسة خصوبة، وما المعايير لتقييم وتحديد ما إذا كان العلاج أو حذف الجينات تؤثر على الخصوبة.
Introduction
المرحلة الانتقالية من خلال سن البلوغ مطلوب لبلوغ مرحلة النضج الجنسي والكفاءة التناسلية. الانتقال البلوغ والحفاظ على معدل الخصوبة في سن البلوغ ينظم المحور الإنجابية، كما وصف المحور طائي جوندال الغدة النخامية (الشكل 1). وينظم توقيت بداية البلوغ والحفاظ على خصوبة محكم العوامل الداخلية، فضلا عن البيئة زيادة فرص البقاء على قيد الحياة للأبناء والآباء والأمهات1،2. يوفر هذا البروتوكول نهجاً غير الغازية لتحديد بداية البلوغ في الفئران والجرذان للتأكد من النضج الجنسي قبل إعداد دراسة خصوبة لتقييم الكفاءة التناسلية.
دراسة خصوبة في الحيوانات الناضجة جنسياً ويمكن أن تبدأ بعد أن مرت الحيوانات إلى سن البلوغ. قبل بداية البلوغ، محور الإنجابية هادئة، والدافع الرئيسي للنضج الجنسي، تروج – الإفراج عن هرمون (GnRH)، يطلق على الغدة النخامية بكميات غير كافية الشروع في سن البلوغ (الشكل 1). بداية البلوغ هو عملية معقدة والتي ينتج عنها زيادة جنره الإفراج في نيافة الوسيط. جنره يشجع الهرمون (LH) والمسام تحفيز إفراز هرمون (FSH) من الغدة النخامية، هما هرمونات ضرورية نضج جوندال ووظيفتها الإنجابية (الشكل 1)3،،من45 .
الإهانات إلى المحور الإنجابية يؤدي إلى انخفاض الخصوبة ويمكن أيضا التقدم أو التأخر في بداية البلوغ. وتشمل الشروط المعروفة للتأثير في توقيت بداية البلوغ والكفاءة الإنجابية التعرض للمواد الكيميائية6،7،1،وزن الجسم ارتفع أو انخفض8تغييرات في الصماء 2،طول اليوم9 والطفرات الوراثية10،11،،من1213،،من1415.
بداية مرحلة النضج الجنسي هو خطوة حاسمة يتعين استكماله قبل إعداد مقايسة خصوبة. مزايا تحديد بداية البلوغ من خلال فصل بريبوتيال وفتح المهبل والسفاد الأول، هي الخصائص غير الغازية لهذه الإجراءات، كما أنها لا تتطلب جمع الدم أو التضحية بالحيوان16، 17.
بعد أن يتم تحديد بداية البلوغ، بشكل صحيح إعداد دراسة خصوبة سوف توفر معلومات هامة حول السلامة المحور الإنجابية، وعادة ما يكون له ميزة ثانية لتوليد الحيوانات التجريبية لإجراء مزيد من الدراسات (التنقيح) 18-إعداد دراسة الخصوبة الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن الكشف عن العجز في الصغيرة والكبيرة على حد سواء في الكفاءة التناسلية في الذكور والإناث. مفتاح معلمات تقييم تشمل 1) الوقت للقمامة الأولى، 2) عدد ليتر ولدت في حجم 3) القمامة وإطار زمني معين. وأخيراً، ترد توصيات لنوع متابعة الدراسات التي يمكن إجراؤها لتحديد سبب ضعف الخصوبة.
وصف البروتوكول يشير إلى الفئران وبيانات تمثيلية تعكس العمل المنجز في الفئران المعدلة وراثيا. ومع ذلك، كافة البروتوكولات شملت تصلح أيضا في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
الرفاه العام للفئران أمر بالغ الأهمية ل تحليل خصوبة ناجحة21. عند القيام تحليل خصوبة، من المهم أن لا جسديا التحقق في الفئران كل يوم كهذا يمكن أن يسبب الإجهاد. كذلك تجنب التغييرات المتكررة القفص، أن هذه أيضا مرهقة. من الناحية المثالية سوف يتم التغييرات القفص لا يزيد عن 1-2 مرات في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أشكر المؤلف المساهمة في الأعمال الأولية التي هي الأساس لهذا المنشور. بفضل أيتور أغيري، جنفييف هاء ريان وايريكا ل. للحصول على تعليمات إعداد المخطوطة. وبفضل جيسيكا لي سورا والذقن أوستن للمساعدة التقنية مع المخطوطة. وأيد H.M.H. يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل والتنمية البشرية من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم R00HD084759.
Materials
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. . Reproduction. , (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. . The Laboratory Mouse. , (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology — Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
