Bestimmung der reproduktive Kompetenz durch Bestätigung pubertären Beginn und Durchführung eines Fruchtbarkeit Assays bei Mäusen und Ratten
Summary
Viele Behandlungen und genetische Mutationen beeinflussen den Zeitpunkt der Geschlechtsreife und Fruchtbarkeit. Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur Evaluierung der pubertären Ausbruch bei Mäusen und Ratten vor der Einrichtung einer Fruchtbarkeit Studie bei geschlechtsreifen Tieren.
Abstract
Beurteilung der reproduktive Kompetenz ist entscheidend für das Verständnis der Wirkung einer Behandlung oder Genmanipulation auf der reproduktiven Achse, auch genannt die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse. Die reproduktiven Achse ist ein wichtiger Integrator von Umwelt- und internen Eingang Anpassung der Fruchtbarkeit zu günstigen Bedingungen für die Reproduktion. Vor dem Einschiffen auf einer Fruchtbarkeit Studie an Mäusen und Ratten, Geschlechtsreife wird ausgewertet, um die Möglichkeit auszuschließen, die durch die beobachteten reproduktiven Phänotypen entstehen verzögerte oder fehlende pubertären auftreten. Dieses Protokoll beschreibt einen nicht-invasive Ansatz um pubertäre auftreten bei Männern durch die Bestimmung der Präputial Trennung und bei Frauen durch vaginale Öffnung und erste Brunst zu beurteilen. Nach der Bestätigung der Abschluss der Pubertät und das Erreichen der Geschlechtsreife kann eine Fruchtbarkeit Studie initiiert werden. Das Verfahren beschreibt die optimale Brutbedingungen für Mäuse und Ratten, eine Fertilitätsstudie einrichten und welche Parameter zu beurteilen und festzustellen, ob die Behandlung oder gen Löschung auf die Fruchtbarkeit auswirkt.
Introduction
Der Übergang durch die Pubertät ist erforderlich, um die sexuelle Reife und reproduktive Kompetenz zu erreichen. Der pubertären Übergang und die Erhaltung der Fruchtbarkeit im Erwachsenenalter unterliegt der reproduktiven Achse, auch genannt die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden Achse (Abbildung 1). Das Timing der pubertären Ausbruch und Wartung der Fruchtbarkeit ist durch interne als auch die ökologischen Faktoren erhöhen die Überlebenschancen der Nachkommen und Eltern1,2streng reguliert. Dieses Protokoll bietet einen nicht-invasive Ansatz ermitteln pubertären Ausbruch bei Mäusen und Ratten, Geschlechtsreife vor der Einrichtung einer Fruchtbarkeit Studie reproduktive Kompetenz beurteilen zu bestätigen.
Eine Fruchtbarkeit Studie ist bei geschlechtsreifen Tieren durchgeführt und kann eingeleitet werden, nachdem die Tiere Pubertät durchlaufen haben. Vor pubertären Ausbruch die reproduktiven Achse ist Ruhestrom und wesentliche Treiber der sexuellen Reifung, Gonadotropin – Releasing Hormon (GnRH), erscheint auf der Hypophyse in unzureichenden Mengen, Pubertät (Abbildung 1) zu initiieren. Pubertären Ausbruch ist ein komplexer Prozess, der zu erhöhten GnRH-Freisetzung in die mittlere Eminenz führt. GnRH fördert Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikel-stimulierende (FSH) Hormonsekretion aus der Hypophyse, zwei Hormone, die wichtig für die Gonaden Reifung und reproduktive Funktion (Abbildung 1)3,4,5 .
Beleidigungen der reproduktiven Achse verminderte Fruchtbarkeit zur Folge und können auch vorab oder Verzögerung pubertären Ausbruch. Bekannt, dass das Timing der pubertären Ausbruch und reproduktive Kompetenz beeinflussen Bedingungen gehören die Exposition gegenüber Chemikalien6,7, erhöht/verringert Körper Gewicht1,8, Änderungen in der endokriner 2,Tag Länge9 und Genmutationen10,11,12,13,14,15.
Beginn der Geschlechtsreife ist ein entscheidender Schritt, die vor der Einrichtung einer Fruchtbarkeit Tests abgeschlossen werden muss. Die Vorteile pubertären Ausbruch durch Präputial Trennung, vaginale Öffnung und erste Brunst zu bestimmen sind die nicht-invasive Eigenschaften dieser Verfahren, da sie keine Blutentnahme oder Opfer der Tiere16, erfordern 17.
Nachdem pubertären Ausbruch festgelegt ist, korrekt Einrichten einer Fruchtbarkeit Studie liefern wichtige Informationen über die Integrität der reproduktiven Achse und hat in der Regel den zweiten Vorteil der Erzeugung von Versuchstieren auf ein weiterführendes Studium (Refinement) 18. die Fruchtbarkeit Studie Setup beschrieben in diesem Protokoll kann kleinere und größere Defizite in reproduktive Kompetenz in Männchen und Weibchen erkennen. Wichtige Parameter ausgewertet sind (1) Zeit, der erste Wurf, 2) Anzahl der Würfe, die in einem bestimmten Zeitrahmen und 3) Wurf Größe erzeugt. Schließlich gehören Empfehlungen für die Art der Follow-up-Studien, die durchgeführt werden, um die Ursache der Beeinträchtigung der Fruchtbarkeit zu identifizieren.
Das beschriebene Protokoll bezieht sich auf Mäuse und repräsentativen Daten spiegeln Arbeit in transgenen Mäusen. Jedoch sind alle enthalten Protokolle gleichermaßen gültig bei Ratten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das allgemeine Wohlbefinden der Mäuse ist entscheidend für eine erfolgreiche Fruchtbarkeit Assay21. Wenn Sie eine Fruchtbarkeit Test durchführen, ist es wichtig, nicht physisch an den Mäusen täglich überprüfen, da dies zu Stress führen kann. Weitere häufige Käfig Änderungen zu vermeiden sind auch stressig. Im Idealfall werden Käfig Änderungen nicht mehr als 1-2 mal pro Woche erfolgen. Belichtung während der Dunkelphase wirkt sich negativ auf die Zucht in den nächtlichen Nagetieren. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich danke die Autoren einen Beitrag an die erste Arbeit, die die Grundlage dieser Veröffentlichung ist. Dank Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan und Erica L. Schoeller für Hilfe bereitet das Manuskript. Vielen Dank Jessica Sora Lee und Austin Kinn für technische Hilfe mit dem Manuskript. H.M.H. wurde von Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R00HD084759 unterstützt.
Materials
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. . Reproduction. , (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. . The Laboratory Mouse. , (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology — Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
