Determinação da competência reprodutiva, confirmando o início puberal e realizando um ensaio de fertilidade em camundongos e ratos
Summary
Muitos tratamentos e mutações genéticas impactam o momento da maturidade sexual e fertilidade. Este protocolo descreve um método não-invasivo para avaliar o início puberal em camundongos e ratos antes da criação de um estudo de fertilidade em animais sexualmente maduros.
Abstract
Avaliação da competência reprodutiva é fundamental para a compreensão do impacto de um tratamento ou manipulação genética do eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. O eixo reprodutivo é um integrador de chave de entrada interna e ambiental adapta a fertilidade de condições favoráveis para a reprodução. Antes de embarcar em um estudo de fertilidade em ratos e ratos, a maturidade sexual é avaliada para excluir a possibilidade de que os fenótipos reprodutivos observados são causados por atraso ou ausência de início puberal. Este protocolo descreve uma abordagem não-invasivo para avaliar o início puberal em machos através da determinação da separação prepucial e nas fêmeas através da abertura vaginal e do primeiro estro. Após a confirmação da conclusão da puberdade e a consecução da maturidade sexual, um estudo de fertilidade pode ser iniciado. O procedimento descreve as condições de reprodução ideal para ratos e ratos, como configurar um estudo de fertilidade e quais os parâmetros para avaliar e determinar se o tratamento ou supressão do gene tem um impacto sobre a fertilidade.
Introduction
A transição da puberdade é necessário para atingir a maturidade sexual e reprodutiva competência. A transição da puberdade e a manutenção da fertilidade na idade adulta é regulada pelo eixo reprodutivo, também denominado o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal (Figura 1). O calendário de início puberal e manutenção da fertilidade é fortemente regulamentados por fatores internos, bem como ambientais para aumentar as chances de sobrevivência da prole e os pais de1,2. Este protocolo fornece uma abordagem não-invasivo para determinar o início puberal em camundongos e ratos para confirmar a maturidade sexual antes da criação de um estudo de fertilidade para avaliar a competência reprodutiva.
Um estudo de fertilidade é executado em animais sexualmente maduros e pode ser iniciado depois que os animais passaram pela puberdade. Antes início puberal, o eixo reprodutivo é quiescente, e o principal motor da maturação sexual, hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), é liberado para a hipófise em quantidades insuficientes para iniciar a puberdade (Figura 1). Início puberal é um processo complexo que resulta em maior liberação de GnRH na eminência da mediana. GnRH promove o hormônio luteinizante (LH) e folículo-estimulante de secreção de hormônio (FSH) da hipófise, dois hormônios essenciais para a maturação gonadal e função reprodutiva (Figura 1)3,4,5 .
Insultos ao eixo reprodutivo resultam em redução da fertilidade e podem também início puberal adiantamento ou atraso. Condições conhecidas para influenciar o momento do início puberal e competência reprodutiva incluem a exposição a endócrinos produtos químicos6,7,1,do peso de corpo aumentou/diminuiu8, mudanças na comprimento de dia2,9 e mutações genéticas10,11,12,13,14,15.
O início da maturidade sexual é um passo crítico que precisa ser concluído antes da criação de um ensaio de fertilidade. As vantagens de determinar o início puberal através de separação prepucial, abertura vaginal e o primeiro estro, são as características não-invasivo desses procedimentos, que não requerem a coleta de sangue ou sacrifício do animal16, 17.
Após início puberal é determinado, corretamente, configurando um estudo de fertilidade irá fornecer informações importantes sobre a integridade do eixo reprodutivo e geralmente tem a segunda vantagem de gerar animais experimentais para estudos adicionais (refinamento) 18. a instalação de estudo de fertilidade descrita neste protocolo pode detectar pequenos e grandes déficits em competência reprodutiva em machos e fêmeas. Principais parâmetros avaliados incluem 1) tempo para a primeira ninhada, 2) número de ninhadas gerado em um determinado tamanho de tempo e maca 3). Finalmente, as recomendações para o tipo de acompanhamento de estudos, que pode ser realizado para identificar a causa de deficiência de fertilidade estão incluídas.
O protocolo descrito refere-se aos ratos e os dados representativos refletem o trabalho realizado em ratos transgénicos. No entanto, todos os protocolos incluídos são igualmente válidos em ratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O bem-estar geral dos ratos é fundamental para um ensaio de fertilidade bem sucedida21. Ao realizar um ensaio de fertilidade, é importante verificar fisicamente não nos ratos todos os dias pois isso pode causar estresse. Mais Evite mudanças frequentes de gaiola, como estas também são estressantes. Idealmente as alterações gaiola serão feitas não mais do que 1 – 2 vezes por semana. Exposição à luz durante a fase de escura impacta negativamente reprodutores em roedores noturnos. Não li…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradeço os autores que contribuem para o trabalho inicial, que é a base desta publicação. Graças a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan e Erica L. Schoeller para ajudar a preparar o manuscrito. Graças a Jessica Lee de Sora e queixo de Austin para assistência técnica com o manuscrito. H.M.H. foi apoiado por Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil & desenvolvimento humano do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R00HD084759.
Materials
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
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