ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析
Summary
プロトコル植物の解明のためチラコイドのタンパク質の複雑な組織と組成ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルとゲルの電気泳動 (BN-PAGE) と 2 D SDS ページの説明。プロトコルは、シロイヌナズナ、最適です、マイナーな修正と他の植物種に使用できます。
Abstract
光合成電子伝達鎖 (など) は、NADPH および ATP の形で化学エネルギーに太陽エネルギーを変換します。4 つの大きい蛋白質の複合体は、チラコイド膜の収穫 NADP+ 経由で2 ダメージを与えるに水から電子をドライブし、ATP の生産のために作成したプロトンの勾配を使用するための太陽エネルギーに埋め込まれます。光化学系 II 光化学系 PSI、チトクローム b6f (チトクローム b6f) および atp アーゼは、異なる方向とチラコイド膜ダイナミクスと多蛋白質複合体すべてです。ネイティブのゲルの電気泳動分離に続く穏やかな洗剤によって、複合体膜の完全性を可で組成、チラコイド膜蛋白質の複合体の相互作用に関する貴重な情報を得ることが、複合体。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブと機能的な形で蛋白質の複合体の分離に使用される手法です。詳細な構造解析のための蛋白質の複雑な浄化の方法を使用できますが、タンパク質複合体の動的相互作用を分析するためのツールも用意されています。メソッド、ミトコンドリア呼吸系膜タンパク質の解析用に開発されたが、以来最適化、チラコイドのタンパク質複合体の解離のために改善します。ここでは、不安定な光合成タンパク質複合体とシロイヌナズナにおけるそれらの相互作用の分析の詳しい最新のプロトコルを提供します。
Introduction
大規模な multisubunit 蛋白質複合体の光化学系 PSI と PSII、Cyt b6f と ATPase 光合成の明反応で NADPH および ATP の生産を調整します。高等植物葉緑体密着グラナを有し、非密着の実質チラコイド構造的に異種の膜構造は、チラコイド膜の複合体があります。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブおよび生物学的にアクティブな形で大規模な multisubunit 蛋白質複合体の解析に広く使用された方法です。メソッドは、ミトコンドリア膜タンパク質複合体1の解剖のために設立されましたが、チラコイド膜ネットワーク3からの蛋白質の複合体の分離の後でカスタマイズされています。(I) の構造解析、タンパク質複合体のネイティブ相互作用を決定するためには (ii) と (iii) 蛋白質複合体の全体的な組織の分析のための個々 のチラコイドのタンパク質複合体の精製方法が適してください。環境のキューを変更します。
分離前に蛋白質の複合体は一般に軽度し、蛋白質の複合体のネイティブ構造を維持する厳選された非イオン性洗剤膜から分離されます。洗剤を含んで疎水性と親水性のサイト特定濃度は, 上記フォーム安定するミセルと呼ばれる臨界ミセル濃度 (CMC)。脂質脂質の相互作用の中断と蛋白質の複合体の可溶化 CMC 結果上記洗剤の濃度を増加させます。洗剤の選択には、興味の複雑な蛋白質の安定性と洗剤の可溶化能力によって異なります。日常的に使用されている洗剤には、α/β-ドデシル-maltoside とジギトニンが含まれます。次の天然状態の膜タンパク質の可溶化、不溶性物質が遠心分離によって削除されます。高等植物におけるチラコイド膜が構造で高いというヘテロなといくつかの洗剤 (例えばジギトニン) が選択的に膜3の特定の一部分だけを可溶化します。したがって、それは常に葉緑素含量とクロロフィル a/b を決定することにより選択した洗剤の可溶化能力を決定する重要な蛋白質の複雑な組織または蛋白質の複合体間の相互作用を特徴付ける、可溶化画分の収量および表されたチラコイド (サブ) ドメインをそれぞれ評価する上清の比率。そのままチラコイド成長光順化植物のクロロフィル a/b 比は、通常約 3 chl、チラコイド画分の b 値を豊かにグラナのいずれか/または実質チラコイドを下回る (2.5 ~) (~ 4.5) の合計の値を超えるかチラコイド、それぞれ。
タンパク質複合体に負の電荷を提供するには、Coomassie ブリリアント ブルー (CBB) 染料は可溶化されたサンプルに追加されます。電荷移動による蛋白質の複合体は陽極の方に移行、その分子の質量と形状によるとアクリルアミド (AA) グラデーションに区切られます。効果的かつ高分解能の分離は、線形アクリルアミド濃度勾配を使用して実現されます。自分サイズに依存した細孔サイズ制限に達するまで、電気泳動中に蛋白質複合体を陽極に向かって移行します。ポリアクリルアミドのゲルの細孔径によって異なります (i) 総アクリルアミド/ビス– アクリルアミド濃度 (T) と (ii) 架橋剤bis– アクリルアミド モノマー濃度 (C) 合計モノマー4を基準にして。BN ページと分離後、タンパク質複合体はさらに 2 番目の次元 (2 D) – SDS のページでに個々 のタンパク質サブユニットに分割できます。ここでは、BN-ページ/2 D-SDS-PAGE によるチラコイド膜蛋白質複合体の分析のための詳しいプロトコルについて述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
光合成エネルギー変換機構は、大規模な multisubunit 蛋白質複合体は、チラコイド膜に埋め込まれているので構成されます。このプロトコルでは、BN-PAGE-2D SDS-PAGE と組み合わせるとシロイヌナズナから植物チラコイドのタンパク質複合体の分析のための基本的な方法について説明します。プロトコルはタバコとほうれん草のチラコイドからチラコイド膜タンパク質の解析にも最適ですが、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の財政上支えられるフィンランド アカデミー (プロジェクト番号 307335 と 303757) および太陽エネルギーによってバイオマス (SE2B) – キュリー ・ スクウォドフスカ助成契約を締結 (675006)。プロトコルは、参考3に基づいています。
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
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