تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق
Summary
بروتوكول لاستجلاء هذه النباتات ثايلاكويد البروتين منظمة معقدة وتكوينها مع الأزرق polyacrylamide الأصلي هلام التفريد (BN-صفحة) وهو وصف 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول هو الأمثل التمويل نبات، ولكن يمكن استخدامها للأنواع النباتية الأخرى مع تعديلات طفيفة.
Abstract
سلسلة نقل الإلكترون الضوئي (إلخ) بتحويل الطاقة الشمسية إلى طاقة كيميائية على شكل ATP و NADPH. أربعة مجمعات البروتين الكبيرة المضمنة في غشاء ثايلاكويد حصاد الطاقة الشمسية لدفع الإلكترونات من الماء إلى NADP+ عن طريق فوتوسيستيمس اثنين، واستخدام التدرج بروتون الذي تم إنشاؤه لإنتاج ATP. بسيي Photosystem، هذه المبادرة والسيتوكروم ب6و (و6ب سيت) ATPase جميع مجمعات مولتيبروتين مع التوجه متميزة والديناميات في غشاء ثايلاكويد. يمكن الحصول على معلومات قيمة حول تكوين وتفاعلات البروتين المجمعات في غشاء ثايلاكويد قبل سولوبيليزينج المجمعات من سلامة الغشاء بالمنظفات خفيفة تليها هلام الأصلية فصل الغرواني الكهربي المجمعات. هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) أسلوب تحليلية المستخدمة لفصل البروتين المجمعات في شكلها الأصلي والوظيفية. يمكن استخدام الأسلوب لتنقية البروتين معقدة للتحليل الهيكلي أكثر تفصيلاً، ولكنه يوفر أيضا أداة لتشريح التفاعلات الدينامية بين مجمعات البروتين. تم تطويره لتحليل البروتين التنفسية المتقدرية المجمعات، الأسلوب ولكن منذ ذلك الحين تم الأمثل وتحسين لتشريح مجمعات البروتين ثايلاكويد. هنا، نحن نقدم بروتوكول حديثة مفصلة لتحليل البروتين التمثيل الضوئي مجا المجمعات وتفاعلاتها في نبات التمويل.
Introduction
فوتوسيستيم مجمعات كبيرة من البروتين مولتيسوبونيت هذه المبادرة وبسيي، سيت ب6و و ATPase تنسيق إنتاج NADPH و ATP في التمثيل الضوئي الضوء ردود. في أعلى النباتات المعايشة، تقع المجمعات في الغشاء ثايلاكويد، الذي بنية غشاء هيكلياً غير متجانسة، تتألف من أبريسيد وجرانة وسدى غير أبريسيد ثيلاكويدس. هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) أسلوب المستخدمة على نطاق واسع في التحليل للمجمعات الكبيرة من البروتين مولتيسوبونيت في شكلها الأصلي والنشيطة بيولوجيا. الأسلوب أنشئت لتشريح غشاء الميتوكوندريا البروتين المجمعات1، ولكن في وقت لاحق تم تخصيصها لفصل البروتين المجمعات من شبكة غشاء ثايلاكويد3. الأسلوب مناسب (ط) لتنقية ثايلاكويد الفردية البروتين المجمعات للتحليل الهيكلي، (الثاني) لتحديد التفاعلات الأصلي بين مجمعات البروتين و (ثالثا) لتحليل التنظيم العام للبروتين المجمعات عند تغيير منبهات بيئية.
قبل الانفصال، البروتين المجمعات المعزولة من الغشاء مع المنظفات النطاق يتم اختيارها بعناية، وعموما معتدل والمحافظة على البنية الأصلية للبروتين المجمعات. المنظفات تحتوي على عمود المصباح ومواقع ماء والمذيلات مستقرة النموذج أعلاه تركيز معينة، دعا إلى تركيز micellar حرجة (CMC). زيادة تركيز المنظفات أعلى نتائج اللجنة العسكرية المركزية في اضطراب التفاعلات الدهنية الدهن وفي سولوبيليزاتيون من البروتين المجمعات. ويتوقف اختيار المنظفات على استقرار البروتين المعقدة للفائدة وعلى القدرة سولوبيليزيشن لمواد التنظيف. وتشمل المنظفات المستخدمة بشكل روتيني α/β-دوديسيل-مالتوسيدي وديجيتونين. بعد solubilization مجمعات البروتين في دولته الأصلية، يتم إزالة المواد غير قابلة للذوبان بالطرد المركزي. في النباتات العليا، الغشاء ثايلاكويد اختلاف كبير في هيكل وبعض المنظفات (مثلاً، ديجيتونين) بشكل انتقائي جعل سوى جزء محدد من الغشاء3. ولذلك، تميز المنظمة البروتين المعقدة أو التفاعلات بين مجمعات البروتين، من الأهمية بمكان لتحديد قدرة solubilization المنظفات المختار دائماً بتحديد محتوى الكلوروفيل والكلوروفيل/b نسبة من المادة طافية لتقييم العائد والمجال ثايلاكويد ممثلة (الفرعية)، على التوالي، في كسر solubilized. نسبة الكلوروفيل/b في ثيلاكويدس سليمة للنمو-الضوء تأقلم النباتات هي عادة حوالي 3، بينما شيلي قيمة ب الكسور ثايلاكويد أثري أما في وجرانة أو ثيلاكويدس ستروما يقع أسفل (~ 2.5) أو تجاوز قيمة الإجمالي (~ 4.5) ثيلاكويدس، على التوالي.
تقديم شحنة سالبة لمجمعات البروتين، يتم إضافة صبغ (مصرف البحرين المركزي) الزرقاء الرائعة أخذ العينة solubilized. سبب تحول التهمة، ترحيل نحو اﻷنود مجمعات البروتين ويتم فصل على تدرج اكريلاميد (أإ) حسب الكتلة الجزيئية والشكل. ويتحقق الفصل فعالة وعالية الدقة باستخدام تدرج تركيز اكريلاميد خطي. أثناء التفريد، ترحيل مجمعات البروتين نحو اﻷنود حتى تصل إلى حد حجم المسام تعتمد على الحجم. حجم المسام من جل polyacrylamide يعتمد على الاكريلاميد (ط) مجموع/مكررا-اكريلاميد تركيز (T) و (ثانيا) على كروسلينكير مكررا-اكريلاميد مونومر تركيز (ج) بالنسبة إلى مجموع مونومرات4. بعد الانفصال مع صفحة الجبهة الوطنية، مجمعات البروتين يمكن كذلك تقسيم إلى تلك المفارز البروتين الفردية بالبعد الثاني (2D)-الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لتحليل ثايلاكويد غشاء البروتين المجمعات من BN-صفحة/2D–الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
إليه تحويل الطاقة الضوئي يتكون من مجمعات البروتين مولتيسوبونيت الكبيرة، التي يتم تضمينها في الغشاء ثايلاكويد. ويصف هذا البروتوكول طريقة أساسية لتحليل ثايلاكويد مصنع البروتين المجمعات من نبات التمويل مع صفحة الجبهة الوطنية جنبا إلى جنب مع 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث كان دعم مالي من أكاديمية فنلندا (أرقام المشاريع 307335 و 303757) والطاقة الشمسية في الكتلة الحيوية (SE2B) ماري Skłodowska-كوري المنحة (675006). البروتوكول يستند على مرجع3.
Materials
| 6-aminocaproic acid (ACA) | Sigma-Aldrich | A2504 | |
| BisTris | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Acrylamide (AA) | Sigma-Aldrich | A9099 | Caution: Neurotoxic! |
| n-dodecyl-β-D-maltoside | Sigma-Aldrich | D4641 | |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| SDS | VWR | 442444H | |
| Urea | VWR | 28877.292 | |
| Glycerol | J.T. Baker | 7044 | |
| Sodium Fluoride (NaF) | J.T. Baker | 3688 | |
| EDTA disodium salt | J.T. Baker | 1073 | |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | Caution:Toxic! |
| Pefabloc SC | Roche | 11585916001 | |
| Serva Coomassie Blue G | Serva | 35050 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| APS (Ammonium persulfate) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | Bio-Rad | 1610801 | |
| (N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide | Omnipur | 2610 | |
| Glycine | Fisher | G0800 | |
| Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) | New England Biolabs | P7708 | |
| Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml | Corning | 352093 | |
| Dual gel caster with 10 x 8 cm plates | Hoefer | SE215 | |
| Gradient maker SG5 | Hoefer | ||
| 0.75 mm T-spacers | Hoefer | SE2119T-2-.75 | |
| Sample gel comb, 0.75 mm | Hoefer | SE211A-10-.75 | |
| Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system | Hoefer | SE250 | |
| IPC-pump | Ismatec | ||
| Power supply, PowerPac HV | Bio-Rad | 164-5097 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Rocker-Shaker | Biosan | BS-010130-AAI | |
PROTEAN II xi Cell |
Bio-Rad | 1651813 |
References
- Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
- Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -. P. Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).
- Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).
- Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches. Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).
- Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. , 384-394 (1989).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).
- Aro, E. -. M., et al. Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes. Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).
- Suorsa, M., et al. Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains. The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).
- Rantala, S., Tikkanen, M. Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation. Plant Direct. 2, 1-12 (2018).
- Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, 951-962 (2017).
