ניקוי קטליטי של הצמח חמצן תגובתי מינים In Vivo על ידי חלקיקי תחמוצת צריום Anionic
Summary
כאן, אנו מציגים עבור פרוטוקול סינתזה ואפיון של חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) עבור ROS (מינים חמצן תגובתי) ניקוי ויוו, nanoceria הדמיה ברקמות הצמח על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, אין ויוו ניטור של nanoceria ROS ניקוי על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Abstract
הצטברות (ROS) מינים חמצן תגובתי מהווה סימן היכר של תגובת המתח והאביוטיים הצמח. ROS לשחק תפקיד כפול צמחים על-ידי מתנהג כמו מולקולות ברמות נמוכות איתות ופגיעה מולקולות ברמה גבוהה. הצטברות של ROS בצמחים לחוץ עלולה לגרום נזק מטבוליטים, אנזימים, ליפידים ו DNA, גרימת הפחתה של צימוח ועם תשואה. היכולת של חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) catalytically ניקוי ROS ויוו מספקת כלי ייחודי כדי להבין bioengineer צמחים לעקת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לסנתז לאפיין פוליפוני (אקרילי) חומצה nanoceria מצופה (PNC), ממשק חלקיקים עם צמחים באמצעות חדירה פרופריה עלה ושל לפקח על ההפצה שלהם, ROS ניקוי ויוו באמצעות קונפוקלי מיקרוסקופ. הנוכחי מולקולרית כלים לטיפול ROS הצטברות בצמחים מוגבלות לדגם מינים ודורשים שיטות טרנספורמציה מפרך. פרוטוקול זה עבור ויוו ROS ניקוי יש פוטנציאל שיוחל פראי סוג צמחים עם עלים רחבים ומבנה העלה כמו תודרנית לבנה.
Introduction
חלקיקי תחמוצת צריום (nanoceria) נמצאים בשימוש נרחב אורגניזמים חיים, ממחקר בסיסי בביו-הנדסה, עקב שלהם מינים חמצן תגובתי קטליטי ברורים (ROS) ניקוי יכולת1,2,3. Nanoceria יש ROS ניקוי יכולות עקב מספר רב של משרות פנויות חמצן משטח זה לסירוגין שני חמצון הברית (Ce3 + ,4 +לסה נ.) 4,5,6. לסה נ3 + משתלשלות איגרות חוב ניקוי יעיל ROS בעוד זנים סריג ב הננומטרי רגנרציה של אתרים אלה פגם באמצעות רכיבה על אופניים תגובות7חמצון-חיזור. Nanoceria גם שימשו לאחרונה ללמוד ולשתול הנדסה פונקציה8,9. צמחים תחת לחץ והאביוטיים חווים הצטברות של ROS, גרימת נזק חמצוני שומנים, חלבונים ו DNA10. בצמחים לבנה א , ניקוי קטליטי nanoceria של ROS ויוו מוביל צמח משופרת פוטוסינתזה תחת אור גבוהה, חום ומדגיש מצמררת8. Nanoceria החלה קרקע גם עליות לירות תשואה ביומסה של דגנים של חיטה (חיטת הלחם)11; שמן קנולה (כרוב napus) הצמחים שטופלו nanoceria יש ביומסה צמח גבוה יותר תחת לחץ מלח12.
Nanoceria מציעים למלחמה ולשתול ביולוגים כלי מבוסס-ננו-טכנולוגיה כדי להבין תגובות הלחץ והאביוטיים ולשפר צמחים לעקת יובש. ויוו ROS הניקוי יכולות של Nanoceria עצמאיות של מיני צמחים, המשלוח נתיישב לרקמות הצמח יש הפוטנציאל לאפשר יישום רחב מחוץ דגם אורגניזמים. בניגוד לשיטות אחרות מבוססות מבחינה גנטית, nanoceria אינם מחייבים יצירת קווים צמח עם ביטוי של אנזימים נוגדי חמצון עבור ROS גבוהה ניקוי יכולת13. עלה פרופריה חדירה של nanoceria צמחים היא גישה מעשית במעבדה מבוסס מחקר.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר סינתזה 1) אפיון טעונים שלילית פוליפוני (אקרילי) חומצה nanoceria (PNC), 2) משלוח ואת המעקב של PNC בכל רחבי עלים תאים ולאחר 3) הפיקוח על התומכים ב- PNC ROS הניקוי ב ויוו. ב פרוטוקול זה, פוליפוני טעונים שלילית (אקרילי) חומצה nanoceria (PNC) מסונתז, המאופיינת שלהם ספקטרום הבליעה, קוטר hydrodynamic, פוטנציאל זטה. אנו מתארים שיטה הסתננות פרופריה עלה פשוטה כדי לספק PNC לתוך הצמח רקמות עלים. עבור ויוו הדמיה של ננו-חלקיק הפצה בתוך תאי mesophyll, צבע פלורסנט (DiI) שימש תווית PNC (DiI-PNC) ולצפות על חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. לבסוף, נסביר כיצד לפקח ויוו PNC ROS ניקוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים PNC סינתזה אפיון, תיוג הפלורסנט, הדמיה קונאפוקלית של חלקיקים בתוך תאי צמחים mesophyll שהפגינו ויוו ROS הניקוי הפעילות שלהם. PNC הם מסונתז מתערובת של חנקת צריום והפתרון במספר דוכנים של אמוניה מימית. PNC מאופיינים spectrophotomery קליטה וריכוז באמצעות החוק באר-Lamberts. מדידות פוטנצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, משרד החקלאות המכון הלאומי של מזון וחקלאות, פתח פרוייקט 1009710 J.P.G. חומר זה מתבסס על עבודה הנתמכים על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט 1817363 מס על J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson’s disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
