Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) dei ROS (specie reattive dell’ossigeno) lo scavenging in vivo, nanoceria imaging nei tessuti vegetali e microscopia confocale in vivo monitoraggio di nanoceria ROS scavenging mediante microscopia confocale.
Abstract
L’accumulo di ossigeno reattivo specie (ROS) è un marchio di garanzia di risposta piante a stress abiotici. ROS giocano un duplice ruolo nelle piante agendo come molecole a bassi livelli di segnalazione e molecole ad alti livelli dannosi. Accumulo di ROS in piante stressati può danneggiare metaboliti, enzimi, lipidi e DNA, causando una riduzione della crescita delle piante e la resa. La capacità di nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) di pulire cataliticamente ROS in vivo fornisce un unico strumento per comprendere e bioingegnere pianta stress abiotici tolleranza. Qui, presentiamo un protocollo per sintetizzare e caratterizzare poli (acrilico) acido nanoceria rivestito (PNC), le nanoparticelle con piante tramite infiltrazione della lamina foglia di interfaccia e monitorare la loro distribuzione e ROS lo scavenging in vivo mediante confocale microscopia. Corrente strumenti molecolari per la manipolazione di accumulo di ROS nelle piante sono limitati a specie modello e richiedono metodi di trasformazione laboriosa. Questo protocollo per in vivo lo scavenging ROS ha il potenziale per essere applicato a tipo selvaggio piante con foglie larghe e struttura foglia come Arabidopsis thaliana.
Introduction
Nanoparticelle di ossido di cerio (nanoceria) sono ampiamente usate negli organismi viventi, dalla ricerca di base alla bioingegneria, dovuto la loro specie distinte catalitica reattive dell’ossigeno (ROS) lo scavenging capacità1,2,3. Nanoceria avere ROS scavenging capacità a causa di un gran numero di posti vacanti di superficie ossigeno che si alternano tra due ossidazione stati (Ce3 + e Ce4 +) 4,5,6. I legami pendenti Ce3 + puliscono efficacemente ROS mentre i ceppi della grata su nanoscala promuovono la rigenerazione di questi siti difetto via redox che ciclano reazioni7. Nanoceria sono stati recentemente utilizzati anche per lo studio e ingegneria impianto funzione8,9. Piante sotto stress abiotici verificano accumulo di ROS, causando il danno ossidativo dei lipidi, proteine e DNA10. In impianti di a. thaliana , nanoceria catalitica scavenging dei ROS in vivo conduce alla fotosintesi delle piante migliorate sotto alta luce, calore e agghiacciante sottolinea8. Nanoceria l’applicazione al suolo anche aumenti sparare resa biomassa e grano di frumento (Triticum aestivum)11; piante di colza (Brassica napus) trattate con nanoceria hanno maggiore biomassa vegetale sotto stress sale12.
Nanoceria offrire bioingegneri e pianta biologi uno strumento basato su nanotecnologie per comprendere le risposte di stress abiotici e migliorare la tolleranza di pianta stress abiotici. In vivo ROS scavenging funzionalità di Nanoceria sono indipendenti di specie vegetali, e la consegna facile nei tessuti vegetali ha il potenziale per consentire ampia applicazione all’esterno di organismi modello. A differenza di altri metodi basati su geneticamente, nanoceria non richiedono generatrici che pianta con la sovraespressione di enzimi antiossidanti per maggiore ROS scavenging capacità13. Infiltrazione della lamina foglia di nanoceria alle piante è un approccio pratico per ricerche di laboratorio.
L’obiettivo generale del presente protocollo è per descrivere 1) la sintesi e caratterizzazione di carica negativa poli (acrilico) acido nanoceria (PNC), 2) la consegna e il rilevamento di PNC in tutto cellule di foglia e 3) il monitoraggio del PNC-attivata ROS scavenging in vivo. In questo protocollo, caricate negativamente poli (acrilico) acido nanoceria (PNC) vengono sintetizzati e caratterizzati da loro spettro di assorbimento, diametro idrodinamico e potenziale zeta. Descriviamo un metodo di infiltrazione della lamina semplice foglia per consegnare PNC in pianta tessuti fogliari. Per l’imaging in vivo della distribuzione delle nanoparticelle all’interno delle cellule del mesofillo, un colorante fluorescente (DiI) è stato utilizzato per etichettare PNC (DiI-PNC) e osservare le nanoparticelle tramite microscopia a fluorescenza confocale. Infine, spieghiamo come monitorare in vivo PNC ROS scavenging attraverso microscopia confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo PNC sintesi, caratterizzazione, colorante fluorescente etichettatura e la formazione immagine confocal delle nanoparticelle all’interno delle cellule del mesofillo di pianta per esibire la loro attività lavaggio in vivo ROS. PNC sono sintetizzati da una miscela di nitrato di cerio e PAA soluzione in idrossido di ammonio. PNC sono caratterizzati da spectrophotomery di assorbimento e la concentrazione determinata usando la legge di Lambert-Beer. Misure di potenziale Zeta ha confe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla University of California, Riverside e USDA National Institute of Food e agricoltura, progetto portello 1009710 a J.P.G. Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation sotto Grant n. 1817363 per J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
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