Katalytisk rensning av växten reaktivt syre arter In Vivo av anjon Cerium Oxide nanopartiklar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för syntes och karakterisering av cerium oxide nanopartiklar (nanoceria) för ROS (reaktiva syreradikaler) rensning i vivo, nanoceria imaging i växt vävnader av konfokalmikroskopi, och i vivo övervakning av nanoceria ROS rensning av konfokalmikroskopi.
Abstract
Reaktivt syre arter (ROS) ackumulering är ett kännetecken för växt abiotisk stress svar. ROS spelar en dubbel roll i växter genom att agera som signalmolekyler på låga nivåer och skadliga molekyler på höga nivåer. Ansamling av ROS i stressade växter kan skada metaboliter, enzymer, lipider och DNA, orsakar en minskning av växters tillväxt och avkastning. Cerium oxide nanopartiklar (nanoceria) förmåga att katalytiskt rensa ROS i vivo ger en unikt verktyg att förstå och bioengineer växt abiotisk stresstålighet. Här presenterar vi ett protokoll för att syntetisera och karakterisera poly (akryl) syra belagda nanoceria (PNC), gränssnitt nanopartiklarna med växter via leaf lamina infiltration och övervaka sin distribution och ROS rensning i vivo med confocal mikroskopi. Aktuella molekylära verktyg för att manipulera ROS ackumulering i växter är begränsad till modell arter och kräver mödosamma transformation metoder. Detta protokoll för i vivo ROS rensning har potential att användas för vildtyp växter med breda blad och löv struktur som Arabidopsis thaliana.
Introduction
Cerium oxide nanopartiklar (nanoceria) används allmänt i levande organismer, från grundforskning till bioteknik, på grund av deras distinkta katalytisk reaktiva syreradikaler (ROS) rensning förmåga1,2,3. Nanoceria har ROS rensning förmåga på grund av ett stort antal ytan syre vakanser som växlar mellan två oxidation (CE-3 + och Ce4 +) 4,5,6. CE-3 + dinglande obligationerna rensar effektivt ROS medan de galler stammarna på nanonivå främja regenerering av dessa defekt platser via redox cykling reaktioner7. Nanoceria har också nyligen använts för att studera och engineering plantera funktion8,9. Växter under abiotisk stress uppleva ansamling av ROS, orsakar oxidativa skador på lipider, proteiner och DNA10. I A. thaliana växter leder nanoceria katalytisk rensning av ROS i vivo till förbättrad växt fotosyntesen under hög ljus, värme och kylning betonar8. Tillämpa nanoceria att jord också ökar skjuta biomassa och korn avkastning av vete (Triticum aestivum)11. raps (Brassica napus) växter behandlas med nanoceria har högre växtbiomassa under salt stress12.
Nanoceria erbjuder bioengineers och plantera biologer ett nanoteknikbaserade verktyg för att förstå abiotisk stress svaren och förbättra anläggningen abiotisk stresstålighet. Nanocerias i vivo ROS rensning funktioner är oberoende av växtarter och lättköpt leverans till växt vävnader har potential att möjliggöra bred tillämpning utanför modellorganismer. Till skillnad från andra genetiskt-baserade metoder, nanoceria inte kräver radgenerering växt med överuttryck av antioxidant enzymer för högre ROS rensning förmåga13. Leaf lamina infiltration av nanoceria växter är ett praktiskt tillvägagångssätt för lab-baserad forskning.
Det övergripande målet med detta protokoll är att beskriva 1) syntesen och karakterisering av negativt laddade poly (akryl) sura nanoceria (PNC), 2) leverans och spårning av PNC hela blad celler, och 3) övervakningen av PNC-aktiverade ROS rensning i vivo. I detta protokoll är negativt laddade poly (akryl) sura nanoceria (PNC) syntetiseras och kännetecknas av deras Absorberingsspectrum, hydrodynamisk diameter och zeta potential. Vi beskriver en enkel leaf lamina infiltration metod för att leverera PNC in växten leaf vävnader. För in-vivo imaging av nanopartiklar distribution inom mesophyll celler användes ett fluorescerande färgämne (DiI) att märka PNC (DiI-PNC) och iaktta nanopartiklarna via confocal fluorescensmikroskopi. Slutligen förklarar vi hur du övervakar i vivo PNC ROS rensning genom konfokalmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll beskriver vi PNC syntes, karakterisering, fluorescerande färgämne märkning och confocal avbildning av nanopartiklarna inom mesophyll växtceller att ställa ut sin i vivo ROS rensning verksamhet. PNC syntetiseras från en blandning av cerium nitrat och PAA lösning i ammoniumhydroxid. PNC kännetecknas av absorption spectrophotomery och den koncentration som fastställs med hjälp av öl-Lamberts lag. Zeta potential mätningar bekräftade negativt laddade ytan av PNC för att förbättra lev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av University of California, Riverside och USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk, Hatch projektet 1009710 till J.P.G. Detta material bygger på arbete stöds av National Science Foundation under Grant nr 1817363 till J.P.G.
Materials
| Cerium (III) nitrate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 238538-100G | |
| Molecular Biology Grade Water, Corning | VWR | 45001-044 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | VWR | 14-959-49A | |
| Poly (acrylic acid) 1,800 Mw | Sigma-Aldrich | 323667-100G | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessory, Insert Retainer | Fisher Scientific | 02-215-391 | |
| Fisherbrand Digital Vortex Mixer Accessories: Foam Insert Set | Fisher Scientific | 02-215-395 | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 05002-1L | |
| PYREX Griffin Beakers, Graduated, Corning | VWR | 13912-149 | |
| RCT basic | IKA | 3810001 | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5424 | VWR | 80094-126 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Millipore-Sigma | UFC901024 | |
| Allegra X-30 Series Benchtop Centrifuge | Beckman Coulter | B06314 | |
| UV-2600 Sptecrophotometer | Shimadzu | UV-2600 120V | |
| Whatman Anotop 10 syringe filter | Sigma-Aldrich | WHA68091102 | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Zetasizer Nano S | Malvern Panalytical | Zen 1600 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma-Aldrich | 42364-100MG | |
| Dimethyl Sulfoxide, ACS | VWR | BDH1115-1LP | |
| Sunshine Mix #1 LC1 | Green Island Distributors, Inc | 5212601.CFL080P | |
| Adaptis 1000 | Conviron | A1000 | |
| TES, >99% (titration | Sigma-Aldrich | T1375-100G | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Air-Tite All-Plastic Norm-Ject Syringe | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Carolina Observation Gel | Carolina | 132700 | |
| Corning microscope slides, frosted one side, one end | Sigma-Aldrich | CLS294875X25-72EA | |
| Cork Borer Sets with Handles | Fisher Scientific | S50166A | |
| Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | P9900-25G | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1 | VWR | 48366-045 | |
| Leica Laser Scanning Confocal Microscope TCS SP5 | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D6883-250MG | |
| Dihydroethidium | Sigma-Aldrich | D7008-10MG | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Eppendorf Uvette cuvettes | Sigma-Aldrich | Z605050-80EA | |
| Chlorophyll meter | Konica Minolta | SPAD-502 |
References
- Xu, C., Qu, X. Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications. NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).
- Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine. Antioxidants. 5 (2), 15 (2016).
- Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications. Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).
- Walkey, C., et al. Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles. Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).
- Pulido-Reyes, G., et al. Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states. Scientific reports. 5, 15613 (2015).
- Dutta, P., et al. Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles. Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).
- Boghossian, A. A., et al. Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting. Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).
- Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species. ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).
- Giraldo, J. P., et al. Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing. Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).
- Demidchik, V. Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology. Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).
- Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L. Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).
- Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots. Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).
- Wu, H., et al. Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley. Planta. , (2015).
- Pirmohamed, T., et al. Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity. Chemical communications. 46 (16), 2736-2738 (2010).
- Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles. ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).
- Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).
- Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention. Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).
- Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson’s disease. Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).
- Zhao, H., et al. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).
- Sun, C., Li, H., Chen, L. Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications. Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475 (2012).
- Hirano, M., Inagaki, M. Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth. Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).
- Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).
- Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves. Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).
- Fukushima, K., Hasebe, M. Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity. Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).
- Monda, K., et al. Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture. Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).
- Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).
- Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).
